[發明專利]用于檢測食品和飲料中胡蘿卜成分的引物和探針

有效

• 申請號: 201010195113.3
• 申請日: 2010-05-27
• 公開（公告）號: CN101921837A
• 公開（公告）日: 2010-12-22
• 發明（設計）人: 孫敏;徐彪;高宏偉;林超;劉彩霞
• 申請（專利權）人: 山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種利用核酸擴增技術進行植物源性成分快速檢測的方法，具體是一種胡蘿卜成分實時熒光PCR檢測用的引物和探針序列。

背景技術

全球經濟一體化和貿易國際化的的不斷擴大，對于發展中的中國，是機遇也是挑戰。目前，我國已成為世界上第五大農產品出口國，農產品進出口貿易持續增長。美國、歐盟、日本等發達國家和地區為了維護本國的經濟利益，爭奪國際市場，竭力通過名目繁多的檢驗項目和嚴格甚至苛刻的技術標準，對進口農產品設置貿易障礙，導致我國農產品出口增長遭受較大壓力。就進出口的農產品而言，合格的產品，不僅要無毒無害，滿足安全衛生要求；而且要無攙雜攙假，滿足品質要求。其中品質合格，又主要包含兩方面的含義：1.原料來源與標簽一致。2.組分含量與標簽一致。歐盟自2006年1月1日起開始實施新的食品衛生法規，新法規突出了食品生產過程中的可追溯管理與食品的可追溯性，強調食品的身份鑒定標識與健康標識。我國國家標準GB?7718-94《食品標簽通用標準》和國家出入境檢驗檢疫局發布的《進出口食品標簽管理辦法》，也明確提出食品標簽標注內容應與食品相符。為此，國家質檢總局專門發文，要求嚴厲打擊制假制劣的違法行為，對假冒偽劣產品要依法沒收并監督銷毀，追查生產源頭和去向，嚴防流入消費環節。

在食品和飲料的生產與銷售中，產品無標簽或標簽不規范，利用摻雜摻假、以次充好等手段欺騙消費者謀取暴利的事件，國內、國外均屢屢發生。各種原料被加工成食品和飲料成品后，已無法從外觀對其組成進行鑒定。生產者受利益驅動，擅自改變產品組成，或摻入價廉的替代品，或直接減少原料用量，導致產品的真實屬性與標簽不符。這種造假行為不僅僅涉及經濟、營養價值，更直接影響著消費者的健康，可能引發食源性過敏反應。

胡蘿卜是一種質脆味美的家常蔬菜，素有“小人參”之稱，其富含糖類、脂肪、揮發油、胡蘿卜素、維生素A、維生素B1、維生素B2、花青素、鈣、鐵等多種營養成分，常作為食品配料用于制作各種糕點、面食和飲料。胡蘿卜雖營養豐富，但同時也是一種常見的食物過敏原。有文獻報道，胡蘿卜、蘋果、大豆、榛子、獼猴桃、小麥是柏林人最常見的食物過敏原。瑞士專家報道，大約25％的食物過敏者會對胡蘿卜產生過敏反應。《亞運食品安全食品過敏原標識標注》地方技術規范已于2009年頒布實施，規范列出可導致過敏反應的食品名單，要求含有名單上過敏原的亞運食品必須如實標注，胡蘿卜位列其中。鑒于此，盡快建立可靠有效的胡蘿卜成分檢測方法，確保食物標簽真實準確，對于減少食源性過敏反應發生，加強食品過敏原標識管理，改進食品安全，保護消費者利益具有重要意義。

食品中植物源性成分檢測，常采用DNA檢測的方法。以DNA為測試對象的方法與以蛋白為測試對象的方法相比，在食物成分復雜的情況下，目標DNA可以有效提取，受食物基質的影響較小；此外，DNA?比較穩定，不象蛋白質組成那樣受地理條件、季節變化和加工工藝的影響。當前，基于DNA的檢測方法中，實時熒光PCR法以其操作簡便、靈敏、特異、快速、重復性好、定量準確、全封閉反應等優點，得到研究者的普遍認可，成為檢測的重要工具。

發明內容

本發明的目的是針對胡蘿卜抗凍蛋白，設計一組特異性引物和探針，進而建立一種快速檢測胡蘿卜DNA的方法，以克服基于蛋白的檢測方法在某些食品檢測中的局限性，為胡蘿卜成分檢測提供有效工具，確保食品標簽的一致性和消費者的飲食安全。

本發明的主要原理為：針對保守序列設計一組引物(上游引物：5′-CGACAAGCAAGCTTTACTCCAA-3′和下游引物：5′-CGTCTGACACCCATGAGTCTGT-3′)和一條Taqman探針(序列為：5′-FAM-TCAAAACAGCCTTGAAAAACCCCACCA-TAMRA-3′)。進行核酸檢測時，模板DNA經加熱至94-95℃一定時間后，DNA雙鏈解離，引物及Taqman探針與模板特異性結合。探針的5端標記有報告熒光集團，3端有淬滅熒光集團。當探針完整的時候，報告集團所發射的熒光能量被淬滅集團吸收，儀器檢測不到信號。隨著PCR的進行，Taq酶在鏈延伸過程中，遇到與模板結合的探針時，其3′→5′外切核酸酶活性就會將探針切斷，報告集團遠離淬滅集團，其能量不能被吸收，即產生熒光信號。隨著PCR循環的增加，目的片段成指數增長，熒光信號也同步增強，熒光信號的強弱直接反映模板數量。

本發明涉及的胡蘿卜實時熒光PCR檢測用的引物和探針，其序列如下：

(1)上游引物：5′-CGACAAGCAAGCTTTACTCCAA-3′；