[發(fā)明專利]猴泡沫病毒重組抗原ELISA檢測(cè)方法及試劑盒

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010194775.9
• 申請(qǐng)日: 2010-05-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101876660A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-11-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賀爭(zhēng)鳴;栗景蕊;付瑞;李曉波
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)藥品生物制品檢定所
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;C12N15/48;C12N15/70;C07K14/15
• 代理公司: 北京尚誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11322
• 代理人: 魯兵

1.一種猴泡沫病毒的重組抗原ELISA檢測(cè)方法，是用SFV?Gag蛋白C端的前193個(gè)氨基酸構(gòu)成的表位包被酶聯(lián)板，用常規(guī)ELISA方法對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于：所述檢測(cè)方法包括以下步驟：

1)用SFV?Gag蛋白C端的前193個(gè)氨基酸構(gòu)成的表位作為包被抗體包被酶聯(lián)板，洗板；

2)加待測(cè)樣品或已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品一SFV抗血清，洗板；

3)加酶標(biāo)二抗，洗板；

4)加底物顯色；

5)終止反應(yīng)；

6)測(cè)定A492值；

7)分析結(jié)果，得到SFV抗體水平。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于：步驟1)中SFV?Gag蛋白C端的前193個(gè)氨基酸構(gòu)成的表位的包被濃度為5μg/mL；步驟2)中的待測(cè)樣品血清的稀釋度為1∶80；標(biāo)準(zhǔn)品的濃度梯度為10ng/mL、1ng/mL、10^-1ng/mL、10^-2ng/mL、10^-3ng/mL、10^-4ng/mL、10^-5ng/mL、10^-6ng/mL；步驟3)中的二抗為辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酯酶標(biāo)記的羊抗人抗抗體，酶標(biāo)二抗的稀釋度優(yōu)選為1∶30000；步驟1)-3)中的洗滌液均為含0.1％吐溫的1×PBS；步驟7)中的結(jié)果分析方法為：先根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和A492值，利用CurveExpert軟件獲得一個(gè)最佳的曲線方程，并得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，縱坐標(biāo)為A492值；再將樣品和對(duì)照孔的A492值代入曲線方程，并乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，得到樣品和對(duì)照孔的相應(yīng)濃度，即SFV抗體水平，其中樣品的A492值取復(fù)孔的平均值。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的檢測(cè)方法，其特征在于：SFV?Gag蛋白C端的前193個(gè)氨基酸構(gòu)成的表位為經(jīng)原核表達(dá)的重組蛋白，具體方法為：將SFV?Gag蛋白C端的前193個(gè)氨基酸的編碼序列插入大腸桿菌表達(dá)載體中，再將構(gòu)建的重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌，經(jīng)表達(dá)、純化得到高活性的目的蛋白；所述SFV?Gag蛋白C端的前193個(gè)氨基酸的編碼序列具有序列表中序列1的核苷酸序列。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征在于：

所述SFV?Gag蛋白C端的前193個(gè)氨基酸的編碼序列的5’端和3’端還連接有Kpn?I和Sac?I識(shí)別位點(diǎn)；所述連接有Kpn?I和Sac?I識(shí)別位點(diǎn)的SFV?Gag蛋白C端的前193個(gè)氨基酸的編碼序列具有序列表中序列2的核苷酸序列；

所述宿主菌大腸桿菌具體為BL21(DH3)、BL21(DE3，plysS)，E.coli?JM109，E.coli?HB101或E.coli?Top10，優(yōu)選為BL21(DH3)；

用于構(gòu)建所述重組表達(dá)載體的出發(fā)載體可為現(xiàn)有的在上述大腸桿菌中表達(dá)外源基因的表達(dá)載體；其中，以pET30a(+)為出發(fā)載體，構(gòu)建的攜帶有SFV?Gag蛋白C端的前193個(gè)氨基酸的編碼序列的重組表達(dá)載體為pET30a(+)-Gag193。

轉(zhuǎn)化有pET30a(+)-Gag193的重組大腸桿菌為pET30a(+)-Gag193/大腸桿菌BL21(DE3)。

6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的檢測(cè)方法，其特征在于：其中，發(fā)酵工程菌時(shí)需加入IPTG誘導(dǎo)劑，所加入IPTG的濃度為1.0-2.0mM，優(yōu)選為1.5mM，誘導(dǎo)溫度為35-39℃，優(yōu)選為37℃，誘導(dǎo)時(shí)間為1-5小時(shí)，優(yōu)選為3小時(shí)。

7.根據(jù)權(quán)利要求4或5或6所述的檢測(cè)方法，其特征在于：所述目的蛋白的純化方法，包括以下步驟：

1)將菌體重懸于PBS中，離心，上清用脫鹽柱處理；

2)將經(jīng)脫鹽柱處理后的流出液用Ni離子親和層析法純化目的蛋白。

8.一種猴泡沫病毒的重組抗原ELISA檢測(cè)試劑盒，包括SFV?Gag蛋白C端的前193個(gè)氨基酸構(gòu)成的表位。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括第二抗體，即辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酯酶標(biāo)記的羊抗人抗抗體。

10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括檢測(cè)用的洗滌液，為含0.1％吐溫的1×PBS、0.01M?PB液、Tween-20和PBST中的一種或幾種；抗體稀釋液，為0.01M?Tris·HCl緩沖液(pH?8.9)或50mM碳酸鹽緩沖液(pH?9.5)；樣品稀釋液，為含0.5％BSA的PBS液；顯色液，為含0.02％H₂O₂的0.1mol/L檸檬酸、3’，3’，5’，5’-四甲基聯(lián)苯胺或鄰苯二胺溶液；終止反應(yīng)液，為2M?98％H₂SO₄；檢測(cè)板，為ELISA板。