[發明專利]一種用于發酵生產環磷酸腺苷的節桿菌及其應用

有效

• 申請號: 201010191515.6
• 申請日: 2010-06-04
• 公開（公告）號: CN102268385A
• 公開（公告）日: 2011-12-07
• 發明（設計）人: 應漢杰;柏建新;陳曉春;熊健;陳勇
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P19/32;C12R1/06
• 代理公司: 北京泛華偉業知識產權代理有限公司 11280
• 代理人: 曹津燕

技術領域

本發明屬于微生物技術領域，涉及一種高產環磷酸腺苷節桿菌及其應用。

背景技術

環磷酸腺苷是人體內廣泛存在的一種具有生理活性的重要物質，作為細胞內的第二信使，它對糖、脂肪、核酸、蛋白質等的代謝以及合成調節起著重要的作用。臨床上用于治療心絞痛、心肌梗死、心肌炎及心源性休克；對改善風濕性心臟病的心悸、氣急、胸悶等癥狀也有一定的作用；可提高急性白血病結合化療的療效，亦可用于急性白血病的誘導緩解；此外，對老年慢性支氣管炎、各種肝炎和銀屑病也有一定療效。環磷酸腺苷也可作為藥物中間體制備二丁酰環磷酸腺苷和環磷酸腺苷葡甲胺，提高脂溶性，從而更有效地發揮生理及藥理作用。環磷酸腺苷亦可用于畜禽食品添加劑，在離體條件下模擬生長激素的作用，促進畜禽生長，增加優質禽產品產量。

環磷酸腺苷的生產方法有化學合成法、酶法和發酵法三種。國內外產業化生產全部采用化學合成法，以一磷酸腺苷為原料，采用高效分離柱進行中間體分離，該方法溶劑損耗量大，收率低，成本高，產量小，且環境污染嚴重。利用酶法可以高效地催化三磷酸腺苷生成環磷酸腺苷，但是此方法僅僅局限于實驗室階段，離產業化還有一定的距離。

目前，國內還沒有發酵法制備環磷酸腺苷的報道。在國外，1963年馬克曼等在大腸桿菌Crookes株細胞中最早檢出了1.1納克/毫升的環磷酸腺苷。1971年，石山等分離篩選了某種小桿菌No.205?ATCC21376以及數株屬于榜狀桿菌科的細菌，通過化學誘變成抗藥性突變株后，可從葡萄糖直接發酵生成2g/L以上的環磷酸腺苷。1973年，鈴木報道，利用烴同化菌玫瑰色石蠟節桿菌ATCC15584菌株，能以正十四烷為碳源，發酵積累1.4g/L環磷酸腺苷。

離子注入技術作為一種生物品種改良的新技術已在誘變育種、植物轉基因、生命起源和進化以及環境輻射與人類健康等方面取得了一些重要研究成果。其中，在微生物誘變育種的研究中，離子注入已廣泛用于對微生物菌種的誘變育種，并取得了良好效果。離子注入與傳統誘變源相比，除了具有能量沉積效應外，還有動量傳遞、質量沉積及電荷中和與交換效應，是一種將物理誘變和化學誘變特性集于一身的綜合誘變方法，能夠在低劑量注入、細胞損傷較輕的情況下，強烈地影響生物細胞的生理、生化性能，造成遺傳物質的基本單位-堿基的改變，誘發染色體結構變異(余增亮，物理，1997，26(6)：333-338)。趙洪英(天津理工學院學報，2001，17(1)：14-17)等用N⁺離子注入慶大霉素產生菌的成熟孢子，經篩選得到的菌株產抗生素能力提高27.39％。王紀(微生物學雜志，1998，18(4)：25-28)等通過離子注入誘變篩選得到一株遺傳性能穩定的高產菌，得率較出發菌提高55％～60％。姚建銘(生物工程學報，2000(16)：478-481)等應用離子注入誘變篩選得到高產花生四烯酸的一株菌株，并應用于大規模生產，其產量比國外專利報道高1倍。

發明內容

因此，本發明所要解決的技術問題是提供一株環磷酸腺苷的高產發酵。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：

一種用于發酵生產環磷酸腺苷的節桿菌，該節桿菌的保藏編號為CGMCC?No.3584。

這種作為生產菌株的高產環磷酸腺苷的節桿菌的分類命名為節桿菌(Arthrobacter?sp.)A302，目前該菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏單位地址：北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC?No.3584，保藏日期為2010年1月18日。該菌株是通過對土壤篩選到的節桿菌進行低能離子束注入，然后將誘變后的菌株轉接于平板培養基中培養，挑選單菌落轉接于牛肉膏斜面培養，后經含碳源、氮源、無機鹽和水的液體種子培養基和發酵培養基培養從而篩選出的環磷酸腺苷高產菌。

CGMCC?No.3584菌株具有下述性質：

1、菌落形態學特征：

在固體培養基上菌落呈圓形，濕潤，低凸起，表面光滑，直徑為約1.5-2mm；有光澤，菌落呈黃色，幼齡菌為淺黃色，隨著菌齡增加，菌落呈深黃色

2、生理與生化特性：

菌株為專性好氧菌，厭氧條件不生長；氧化酶反應為陰性，接觸酶反應為陽性，硝酸鹽還原反應為陽性；該菌的最佳生長溫度為30℃，最適pH值為7.0，可在pH?10.0下生長；最適的NaCl濃度為1％(質量比)，在NaCl濃度為5％(質量比)時也能生長；有耐熱性(55℃，加熱20分鐘)。

3、16S?rDNA序列分析：