[發(fā)明專利]聯(lián)合分型檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體的方法及試劑盒

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010191451.X
• 申請日: 2010-06-03
• 公開（公告）號(hào): CN101858912A
• 公開（公告）日: 2010-10-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李樹清;王艷;王巧全;張強(qiáng);杜軍;陳志飛
• 申請（專利權(quán)）人: 中華人民共和國上海出入境檢驗(yàn)檢疫局
• 主分類號(hào): G01N33/569
• 分類號(hào): G01N33/569;G01N33/543;G01N21/64
• 代理公司: 上海浦一知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31211
• 代理人: 王函

1.一種聯(lián)合分型檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體的方法，其特征在于，包括如下步驟：

①制備胸膜肺炎放線桿菌多糖抗原；

②制備兔抗胸膜肺炎放線桿菌高免血清并純化；

③制備陰性血清池；

④利用步驟①和②得到的多糖抗原和純化的兔抗胸膜肺炎放線桿菌高免血清建立雙夾心ELISA方法，以初步獲得多糖抗原的工作濃度以及樣本血清稀釋度；

⑤使用步驟②純化的兔抗胸膜肺炎放線桿菌高免血清與液相芯片的微球偶聯(lián)；

⑥采用液相芯片分型聯(lián)合檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體；

⑦確定豬傳染性胸膜肺炎液相芯片檢測陰性或陽性標(biāo)準(zhǔn)判定的閾值。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聯(lián)合分型檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體的方法，其特征在于，步驟①中，所述胸膜肺炎放線桿菌多糖抗原的制備方法具體為：將胸膜肺炎放線桿菌標(biāo)準(zhǔn)參考菌株涂布接種于有0.1％NAD的TSCA培養(yǎng)基上，37℃，放置5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h，用含0.5％甲醛的生理鹽水洗脫下來收集于瓶中，放置于4℃，過夜；次日，8000r/min，離心15min去上清，沉淀用生理鹽水重懸并調(diào)整菌液濃度為10¹⁰CFU/mL；將重新混懸的菌液放置于100℃水浴中作用1h，冷卻后，20000g，離心20min，保留上清；用0.22μm的濾膜過濾上清液，濾液即為多糖抗原，分裝，放-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聯(lián)合分型檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體的方法，其特征在于，步驟②中，所述的兔抗胸膜肺炎放線桿菌高免血清的制備和純化方法具體為：將胸膜肺炎放線桿菌6h的培養(yǎng)物加含0.8％甲醛的生理鹽水37℃滅活24h，離心去甲醛，0.01M?PBS重懸至2x10⁵CFU/mL，加入等體積弗氏不完全佐劑乳化后，分點(diǎn)皮下注射健康成年新西蘭兔，每只體重約2kg，1mL/只，2周后靜脈注射活菌0.5mL，每周2次，共注射3周；靜脈注射第一次用1×10⁹CFU/mL的菌液，以后用2×10⁹CFU/mL的菌液；最后一次注射1周后心臟采血，分離血清小份量分裝，-20℃保存?zhèn)溆?；采用正辛酸和硫酸銨提純抗體，純化兔抗胸膜肺炎放線桿菌高免血清，并用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測定免疫后的兔抗胸膜肺炎放線桿菌高免血清的抗體效價(jià)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的聯(lián)合分型檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體的方法，其特征在于，步驟②中，所述用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測定免疫后的兔抗胸膜肺炎放線桿菌高免血清的抗體效價(jià)大于或等于1∶32。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聯(lián)合分型檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體的方法，其特征在于，步驟③中，所述制備陰性血清池具體為：將不同來源、不同大小的陰性豬血清混合在一起，分裝，作為陰性標(biāo)準(zhǔn)。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聯(lián)合分型檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體的方法，其特征在于，步驟④中，所述的雙夾心ELISA方法具體為：步驟②純化的兔抗胸膜肺炎放線桿菌高免血清經(jīng)1∶100～1∶3200倍比稀釋，相應(yīng)血清型的胸膜肺炎放線桿菌多糖抗原按1∶100～1∶3200倍比稀釋，標(biāo)準(zhǔn)豬陽性血清按1∶100或1∶400稀釋，進(jìn)行方陣滴定，測定胸膜肺炎放線桿菌多糖抗原的最佳稀釋度以及樣本血清稀釋度。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聯(lián)合分型檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體的方法，其特征在于，步驟⑤中，所述的兔抗胸膜肺炎放線桿菌高免血清與微球偶聯(lián)，具體為：將4℃保存的微球放置于室溫20～30min，渦旋微球，按需要量吸取熒光微球加入到1.5毫升的離心管中，13000r/min離心4min去除保護(hù)液，用三蒸水洗滌后，用400μL?0.1M?pH?6.2磷酸緩沖液重懸微球；加入10μL?50mg/mL?Sulfo-NHS和10μL?50mg/ml?EDC，混勻后37℃作用20min；離心去上清，將微球用900μL?0.05M?MES重新懸浮，離心去上清，洗滌微球兩次；用400μL?0.05M?MES重懸微球，加入提純的兔抗App高免血清，混勻后37℃作用2～3h；離心去上清，加入900μLPBS-TBN重懸微球，混勻后離心去上清，洗滌微球兩次；加入200μLPBS-TBN重懸微球，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)。