[發(fā)明專利]一種扇貝酚氧化酶的分離純化方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010191335.8
• 申請日: 2010-06-03
• 公開（公告）號: CN101899425A
• 公開（公告）日: 2010-12-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 邢婧;蔣經(jīng)偉;戰(zhàn)文斌;繩秀珍
• 申請（專利權(quán)）人: 中國海洋大學(xué)
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02
• 代理公司: 青島海昊知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)所有限公司 37201
• 代理人: 王鐸

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及雙殼貝類的酚氧化酶分離純化技術(shù)的改進(jìn)，具體涉及一種扇貝酚氧化酶的分離純化方法，屬于貝類免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

扇貝是低等無脊椎動物，通過非特異性免疫抵御外來病原體的入侵。酚氧化酶(phenoloxidase，簡稱PO)是非特異性免疫的重要因子之一，在微生物多糖等誘導(dǎo)下被激活，催化有關(guān)底物生成醌，最終產(chǎn)生黑色素。PO催化反應(yīng)生成的一系列產(chǎn)物能夠限制和隔離外來物；抑制病原菌胞外蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)的活性；殺死病原體；愈合傷口；起到調(diào)理作用；促進(jìn)血細(xì)胞吞噬和包囊；介導(dǎo)凝集、凝固和其他殺菌物質(zhì)的產(chǎn)生。目前在無脊椎動物中，PO的分離純化大多采用中性鹽(主要指硫酸銨)鹽析結(jié)合柱層析(陰離子交換層析、疏水層析、葡聚糖凝膠層析、瓊脂糖凝膠層析、親和層析和等電聚焦層析)的方法。扇貝體內(nèi)PO的含量非常低，并且其活性對外界環(huán)境非常敏感而極易失活，鹽析與柱層析結(jié)合的方法耗時(shí)長(至少需要72小時(shí))、處理步驟繁多無法在純化的過程中保持PO活性，并且該方法目的蛋白回收率低。因此需要開發(fā)一種簡便高效的分離提純扇貝PO的方法。

非變性電泳(native-PAGE)，是一種快速、簡便的蛋白分析鑒定技術(shù)，其最大限度的保持蛋白在生物體內(nèi)所具有的特性，常與底物發(fā)色技術(shù)相結(jié)合用以確定酶的分子量和同工酶，而連續(xù)梯度非變性電泳能夠更高效準(zhǔn)確地分離目標(biāo)蛋白。電洗脫技術(shù)(electroelution)是一種用于回收凝膠中蛋白的電泳技術(shù)。目前，應(yīng)用連續(xù)梯度非變性電泳-特異性底物發(fā)色-電洗脫等技術(shù)的綜合，在分離純化無脊椎動物PO方面的研究還未見相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種快速、簡便、高效的扇貝酚氧化酶的分離純化方法。

本發(fā)明通過連續(xù)梯度非變性電泳分離扇貝的酚氧化酶，再以特異性底物發(fā)色方法確定目的蛋白位置，并通過電洗脫法回收目的蛋白得到純化的酚氧化酶；最后通過電泳驗(yàn)證提純出的酚氧化酶純度及其亞基組成并應(yīng)用生理生化方法確定提純的酚氧化酶生物學(xué)活性和酶學(xué)特性。

本發(fā)明的技術(shù)方案包括以下步驟：(1)從扇貝的閉殼肌獲得血淋巴，經(jīng)離心、重懸、破碎后離心取上清，獲得血細(xì)胞破碎液上清；(2)以血細(xì)胞破碎液上清為樣品進(jìn)行連續(xù)梯度非變性電泳；(3)以鄰苯二酚為特異性底物發(fā)色，定位酚氧化酶蛋白帶；(4)對目的帶進(jìn)行切膠，通過電洗脫法回收酚氧化酶蛋白帶，經(jīng)透析凍干后得到提純的扇貝酚氧化酶。

按所述的扇貝酚氧化酶的分離純化方法分離純化海灣扇貝(Argopecten?irradians)PO和櫛孔扇貝(Chlamys?farreri)PO，得到結(jié)果如下：純化后的海灣扇貝PO和櫛孔扇貝PO經(jīng)連續(xù)梯度非變性電泳檢測均僅呈現(xiàn)一條帶，分子量分別為477kDa和408kDa左右；經(jīng)變性電泳檢測兩種PO均只有一條帶，海灣扇貝PO和櫛孔扇貝PO分子量分別為54kDa和80kDa左右，表明這兩種PO僅由一種亞基組成；經(jīng)酶標(biāo)板法測PO生物學(xué)活性和酶學(xué)特性，結(jié)果顯示：在海灣扇貝中，純化后的PO總活力(U)是純化前樣品總活力(U)的73.14％，純化后PO特異性活力(U/mg)是純化前樣品特異性活力(U/mg)的413.08倍；在櫛孔扇貝中，純化后的PO總活力(U)是純化前樣品總活力(U)的72.16％，純化后PO特異性活力(U/mg)是純化前樣品特異性活力(U/mg)的533.33倍；兩種酶的活力均可受到溫度、pH、二價(jià)金屬離子和PO抑制物的影響，對不同底物也表現(xiàn)出不同的親和力，具有一定的底物專一性。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：①以血細(xì)胞破碎液上清為樣品，通過連續(xù)梯度非變性電泳與特異性底物發(fā)色和電洗脫技術(shù)結(jié)合起來，實(shí)現(xiàn)了扇貝PO的純化，全過程耗時(shí)短(大約需要48小時(shí))，有利于較好的保持酶的活性；②只需要電泳/洗脫與特異性底物發(fā)色等技術(shù)即可達(dá)到PO的純化，設(shè)備要求簡單，成本低，操作簡便，且大大減少了對樣品的處理步驟，在保持對蛋白的較高分離能力的同時(shí)也有利于保持酶的活性；③提純的樣品純度高，通過非變性與變性電泳檢測只呈現(xiàn)一條帶，并且目的蛋白回收率高，很好的保持了酶的生物活性，提高了提純效率。

附圖說明

圖1為本發(fā)明提純的海灣扇貝PO和櫛孔扇貝PO電泳圖。

其中，(A)為連續(xù)梯度非變性電泳結(jié)果；(B)為變性電泳結(jié)果。

圖2為溫度對本發(fā)明提純的海灣扇貝PO和櫛孔扇貝PO活力的影響圖。

圖3為pH對本發(fā)明提純的海灣扇貝PO和櫛孔扇貝PO活力的影響圖。

圖4為二價(jià)金屬離子對本發(fā)明提純的海灣扇貝PO和櫛孔扇貝PO活力的影響圖。