[發(fā)明專利]櫛孔扇貝血細(xì)胞的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒及其制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010191097.0
• 申請(qǐng)日: 2010-06-03
• 公開（公告）號(hào): CN101846685A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 戰(zhàn)文斌;林聽聽;邢婧;繩秀珍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)海洋大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/577
• 分類號(hào): G01N33/577;G01N33/531
• 代理公司: 青島海昊知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所有限公司 37201
• 代理人: 王鐸

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種應(yīng)用單克隆抗體定量檢測(cè)櫛孔扇貝(Chlamys?farreri)血細(xì)胞的酶聯(lián)免疫(ELISA)檢測(cè)試劑盒及其制備方法，屬于貝類分子免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

貝類缺乏免疫球蛋白和特異性免疫，其免疫防御過程是由血細(xì)胞和血淋巴中的體液因子協(xié)同完成。血細(xì)胞通過自溶、聚集、吞噬、包囊、胞吐、氧化殺傷等方式，達(dá)到識(shí)別、包裹和清除外來(lái)異物的目的；血細(xì)胞還能通過釋放溶菌素、凝集素、調(diào)理素等物質(zhì)來(lái)調(diào)理輔助體液因子免疫，其在貝類抵御外界環(huán)境刺激及外來(lái)病原微生物侵襲的過程中起著關(guān)鍵作用。

櫛孔扇貝是我國(guó)北方沿海貝類養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)種類。近年來(lái)病害頻發(fā)，已逐漸成為限制櫛孔扇貝養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的因素之一。目前櫛孔扇貝多采用海上筏式籠養(yǎng)等養(yǎng)殖方式，但在廣闊的水域中對(duì)病害的發(fā)生、預(yù)防和流行的控制困難較大，因而對(duì)貝類健康狀況的監(jiān)測(cè)顯得尤為重要。已有研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境因子的變化和病原的侵襲可引起扇貝血細(xì)胞數(shù)量的顯著變化。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，扇貝經(jīng)饑餓、高溫或病原刺激后，其血細(xì)胞數(shù)量要明顯低于未刺激的正常扇貝；此外，馬洪明等[高技術(shù)通訊，2006：16(7)，745-751]也報(bào)道扇貝經(jīng)鹽度突降或細(xì)菌感染后，其血細(xì)胞數(shù)量會(huì)驟減；一些國(guó)外學(xué)者也在其他貝類研究中發(fā)現(xiàn)：貝類經(jīng)Cu²⁺、Pb²⁺，干露，缺氧等刺激后，血細(xì)胞數(shù)量會(huì)明顯低于某一正常值，有些甚至死亡。因此，血細(xì)胞數(shù)量的變動(dòng)可以作為一個(gè)評(píng)估扇貝受病原感染或環(huán)境脅迫等的檢測(cè)指標(biāo)。

目前檢測(cè)血細(xì)胞數(shù)量變動(dòng)的方法主要有血球計(jì)數(shù)板法和流式細(xì)胞儀法。血球計(jì)數(shù)板法誤差大、主觀性強(qiáng)、不適用于大規(guī)模樣品檢測(cè)；流式細(xì)胞儀法價(jià)格昂貴，耗材費(fèi)用高，需專門的技術(shù)人員操作、且對(duì)樣品的針對(duì)性不強(qiáng)，易將雜質(zhì)碎片誤認(rèn)為血細(xì)胞。單克隆抗體(以下簡(jiǎn)稱：?jiǎn)慰?具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)常被應(yīng)用于免疫細(xì)胞的定位和病原的定量研究中。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述問題，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種特異性強(qiáng)、精確度高、靈敏度高、重復(fù)性好的應(yīng)用抗櫛孔扇貝血細(xì)胞單抗來(lái)檢測(cè)血細(xì)胞數(shù)量變化的酶聯(lián)免疫(ELISA)檢測(cè)試劑盒，以期評(píng)估養(yǎng)殖扇貝受病原感染或環(huán)境脅迫等的可能，為監(jiān)測(cè)扇貝健康狀況提供依據(jù)。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述櫛孔扇貝血細(xì)胞ELISA檢測(cè)試劑盒的制備方法。

本發(fā)明的ELISA檢測(cè)試劑盒包括：酶標(biāo)板，封閉液，洗滌液，酶標(biāo)記抗體，pNPP底物顯色液，磷酸鹽緩沖液(PBS)，血細(xì)胞抗凝劑，其特征在于所述的試劑盒還包括抗櫛孔扇貝血細(xì)胞單抗，血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品。

其中所述的抗櫛孔扇貝血細(xì)胞單抗是通過收集抗櫛孔扇貝血細(xì)胞的單克隆雜交瘤細(xì)胞1F7的培養(yǎng)上清液，過Protein?G-瓊脂糖親和層析柱，濃縮、透析、純化制得，其特征在于所述的單抗能與櫛孔扇貝各種類型血細(xì)胞(透明血細(xì)胞、顆粒血細(xì)胞)特異性結(jié)合；

所述的血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品是通過收集健康扇貝的血細(xì)胞，經(jīng)重懸、超聲波破碎后制得；

所述的封閉液為含3.0％(w/v)牛血清白蛋白的PBS；

所述的洗滌液為含0.1％(v/v)Tween-20的PBS；

所述的酶標(biāo)記抗體為堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體；

所述的血細(xì)胞抗凝劑為含0.02M?EDTA的PBS。

本發(fā)明的ELISA檢測(cè)試劑盒的制備方法包括下列步驟：

1.制備血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品：取健康的櫛孔扇貝，定量抽取血淋巴，離心后，所得血細(xì)胞沉淀用等量的血細(xì)胞抗凝劑重懸，經(jīng)超聲波破碎，作為本試劑盒的血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品；

2.制備抗櫛孔扇貝血細(xì)胞的單抗：以血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品為抗原免疫小鼠，細(xì)胞融合，經(jīng)間接免疫熒光法篩選，克隆，得到抗櫛孔扇貝血細(xì)胞的單克隆雜交瘤細(xì)胞，其培養(yǎng)上清液即含單抗；選取1株免疫熒光反應(yīng)結(jié)果為強(qiáng)陽(yáng)性，且能與櫛孔扇貝各種類型血細(xì)胞特異性結(jié)合的單抗作為本試劑盒的櫛孔扇貝血細(xì)胞單抗；

3.確定抗原與抗體的最佳使用比例：將上述血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品和血細(xì)胞單抗分別用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行梯度稀釋，通過ELISA棋盤滴定法獲取抗原抗體的適宜反應(yīng)比例，進(jìn)而確定抗原與抗體的最佳使用比例；

4.建立檢測(cè)結(jié)果評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)：分別通過高溫和病原的刺激，應(yīng)用血細(xì)胞單抗的ELISA法檢測(cè)各刺激條件下血細(xì)胞的數(shù)量變化；根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，以常溫和高溫刺激實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果制定扇貝健康狀態(tài)與受環(huán)境脅迫的臨界范圍；以對(duì)照和病原感染實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果制定扇貝受環(huán)境脅迫與病原感染的臨界范圍；在二者之間即為受環(huán)境脅迫的范圍；從而建立評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。