[發(fā)明專利]金黃色葡萄球菌截短SasA蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010190955.X
• 申請日: 2010-06-03
• 公開（公告）號: CN102268444A
• 公開（公告）日: 2011-12-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳薇;易紹瓊;于長明;徐俊杰;侯利華;付玲;任軍;于婷
• 申請（專利權(quán)）人: 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/63;C12N15/70;C12N5/10;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C07K14/31;A61K39/085;A61P31/04
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技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一個金黃色葡萄球菌SasA基因及其編碼蛋白以及作為亞單位疫苗在金黃色葡萄球菌感染預(yù)防方面的應(yīng)用。?

技術(shù)背景：

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus?aureus)是一種重要的革蘭氏陽性條件致病菌，最常見的金黃色葡萄球菌引發(fā)的感染是局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心臟內(nèi)膜炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。大面積燒傷、需進(jìn)行血液透析的患者、早產(chǎn)兒及其他免疫力低下的人群是金黃色葡萄球菌的易感人群。國內(nèi)一項研究結(jié)果表明，燒傷面積大于30％者，40％并發(fā)金黃色葡萄球菌引起的膿毒癥，其中20％的患者最終轉(zhuǎn)為多器官功能障礙綜合癥，50％以上死亡。另據(jù)報道75％的早產(chǎn)兒膿毒癥是由金黃色葡萄球菌引起的。金黃色葡萄球菌感染的經(jīng)典治療是使用抗生素，而多種抗生素抗性菌株的出現(xiàn)，特別是甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌菌株的迅速蔓延和萬古霉素抗性金黃色葡萄球菌菌株的出現(xiàn)，使得疫苗的研制變得更為迫切。?

金黃色葡萄球菌的疫苗研制的最大障礙是金黃色葡萄球菌的毒力因子很多，包括多種毒素、多種粘附分子和莢膜等。金黃色葡萄球菌的SasA蛋白表達(dá)在金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁上，全長由1759個氨基酸組成，分子量約為193kDa。目前有關(guān)該蛋白的功能報導(dǎo)還非常少。?

由于金黃色葡萄球菌毒力相關(guān)蛋白很多，毒力蛋白在臨床分離的菌株中的分布也不一致，目前還沒有有效的針對金黃色葡萄球菌的蛋白疫苗。目前進(jìn)入臨床的針對金黃色葡萄球菌的疫苗是將金黃色葡萄球菌的莢膜多糖CP5和CP8與銅綠假單胞菌的外毒素A偶聯(lián)制成的，在血液透析病人進(jìn)行的三期臨床結(jié)果顯示該疫苗存在一定的有效性。但該疫苗存在的主要問題是需要對莢膜多糖進(jìn)行提取，制備過程復(fù)雜。選擇金黃色葡萄球菌的保護(hù)性抗原開發(fā)基因工程蛋白疫苗是金黃色葡萄球菌疫苗研究的方向。?

在對金黃色葡萄球菌的多個毒力蛋白的免疫保護(hù)效果進(jìn)行分析后，截短SasA被發(fā)現(xiàn)是保護(hù)效果最好的蛋白。本研究擬在大腸桿菌中的可溶性高表達(dá)制備具有天然構(gòu)象的亞單位疫苗，并對該疫苗的免疫劑量、免疫效價、保護(hù)效果等方面進(jìn)行研究并進(jìn)一步探索截短的SasA作為亞單位疫苗可行性，為下一步深入制備金黃色葡萄球菌亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。?

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的是提供一個經(jīng)優(yōu)化后可以在大腸桿菌中進(jìn)行高效可溶性表達(dá)且能夠激發(fā)機(jī)體對金黃色葡萄球菌感染產(chǎn)生免疫保護(hù)作用的金黃色葡萄球菌截短SasA基因及其編碼蛋白在金黃色葡萄球菌亞單位疫苗中的應(yīng)用。?

本發(fā)明所提供的金黃色葡萄球菌截短SasA基因，名稱為tSasA，是下述核苷酸序列之一：?

1)序列表中SEQ?ID?No.1的DNA序列；?

2)編碼序列表中SEQ?ID?No.2的DNA序列；?

3)與序列表中SEQ?ID?No.1限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有激發(fā)機(jī)體對金黃色葡萄球菌感染產(chǎn)生免疫保護(hù)作用的核苷酸序列；?

4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ?ID?No.1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。?

所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。?

序列表中的SEQ?ID?No.1由882個堿基組成，其編碼序列為自5’端第882堿基，編碼具有序列表中SEQ?ID?No.2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。?

所述金黃色葡萄球菌截短SasA基因編碼的蛋白tSasA，是下述氨基酸殘基序列之一：?

1)序列表中的SEQ?ID?No.2；?

2)將序列表中SEQ?ID?No.2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有激發(fā)機(jī)體對金黃色葡萄球菌感染產(chǎn)生免疫保護(hù)作用的蛋白質(zhì)。?

序列表中的SEQ?ID?NO.2由294個氨基酸殘基組成。?

所述取代、缺失或添加的一至十個氨基酸殘基可以使非結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基，其改變不會對該蛋白的功能產(chǎn)生影響。?

含有本發(fā)明基因金黃色葡萄球菌截短SasA基因細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。?

以pET21a(+)為載體，構(gòu)建的含有金黃色葡萄球菌截短SasA基因tSasA的重組原核表達(dá)載體為pET21a-tSasA。?

本發(fā)明還提供了一種表達(dá)金黃色葡萄球菌截短SasA基因編碼蛋白tSasA的方法。?