[發明專利]一種指示微生物生長的顯色顆粒及制備方法

無效

• 申請號: 201010188199.7
• 申請日: 2010-05-28
• 公開（公告）號: CN102262110A
• 公開（公告）日: 2011-11-30
• 發明（設計）人: 孫永軍
• 申請（專利權）人: 丁元生
• 主分類號: G01N27/26
• 分類號: G01N27/26;C12Q1/70;C12Q1/06
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

技術領域

本發明屬于微生物檢測領域；更具體地，本發明涉及一種指示微生物生長的顯色顆粒及制備方法。

背景技術

臨床上致病菌獲得能量的基質主要是糖類，通過糖的氧化或酵解釋放能量，并以高能磷酸鍵的形式(ADP、ATP)儲存能量。細菌生物氧化的類型分為呼吸與發酵。在生物化過程中，細菌的營養物(如糖)經脫氫酶作用所脫下的氫，需經過一系列中間遞氫體(如輔酶Ⅰ、輔酶Ⅱ、黃素蛋白等)的傳遞轉運，最后將氫交給受氫體。以無機物為受氫體的生物氧化過程，稱為呼吸，其中以分子氧為受氫體的稱需氧呼吸；而以無機化合物(如硝酸鹽、硫酸鹽)為受氫體的稱厭氧呼吸。生物氧化中以各種有機物為受氫體的稱為發酵，大多數病原菌只進行需氧呼吸或發酵。多數細菌生長發酵時能還原無色的氯化三苯四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium?chloride，TTC)為紅色的三苯甲臢(TTF)(如下式)，形成紅色集落，三苯甲臢比較穩定，不會被空氣中的氧氣自動氧化。

細胞的生長或細胞活性的檢測經常使用四氮唑MTT(Tetrazolium)法，其原理是活細胞線粒體上的琥珀酸脫氫酶與外源性的MTT發生氧化還原反應，被還原成不溶于水的藍紫色結晶物沉積于細胞內(如下式)，而死細胞無此功能。DMSO能溶解細胞中的紫色臢結晶物，然后酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定光吸收值，就可以間接反映活細胞的數量。

總之，活細胞、細菌生長時均會產生能量代謝，代謝中所需能量，絕大多數是通過生物氧化作用而獲得的，生物氧化即在酶的作用下生物細胞內所發生的系列氧化還原反應。發生氧化還原反應就會發生氫質子傳遞，因此，可通過脫氫酶受氫體又稱氧化還原指示劑(Redox?indicator)來檢測。

氧化還原指示劑是一類脫氫酶受氫體，本質是一類自身具有氧化還原性質的有機試劑，能在特定的電極電位發生明顯的顏色變化，其氧化型與還原型具有不同的顏色。

常用的氧化還原指示劑包括：2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium?chloride，TTC)，3-(4’，5’-二甲基-2-噻唑基)-2，4-二苯基四氮唑溴化物，噻唑藍，溴化噻唑藍四氮唑，噻唑藍，噻唑蘭，3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四氮唑，3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基四氮唑溴化物，溴化-3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基四氮唑，3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-溴代四唑(MTT)，2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-四唑氯(2-(p-iodophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyl-tetrazolium?chloride，INT)，四硝基四氮唑藍(2，2’，5，5’-tetra-(p-nitrophenyl)-3，3’-(3-dimethoxy-4-diphenylene)-ditetrazoliumchloride，TNBT)、氮四唑藍(2，2’-di-(p-nitrophenyl)-5，5’-diphenyl-3，3’dimethoxy-4，4’-diphenylene)-ditetrazolium?chloride，NBT)2，2’-p-二亞苯基-3，3’，5，5’-tetraphenylditetrazoliumchloride(neotetrazolium?chloride)(NTC)、OTC，PTC，MTC，WST等。

其中，四氮唑類(Tetrazolium)物質是氧化還原指示劑中最常見的試劑。這類氧化還原指示劑能非常靈敏的檢測還原性物質，其本身被還原成可見光下可容易辨別的深色臢類物質，在生化檢測、細胞培養及常規細菌的培養、鑒定、藥敏中得到了廣泛的應用。

但是，四氮唑類物質存在以下缺點：

1、四氮唑鹽不穩定，對溫度、濕度和光較為敏感，極易降解，尤其在水溶液中易生成有色產物，其儲存液即使保存在低溫(-20℃)環境也不得超過一個月。四氮唑鹽的降解或變色大大降低了檢測的靈敏度，因此，一般建議四氮唑鹽溶液新鮮配制并盡快用完，這嚴重限制了四氮唑鹽的用途，尤其是在需要有一定保質期的培養、鑒定、藥敏試劑或產品方面的應用。