[發明專利]真菌酸性核酸酶檢測試劑、制備方法及真菌酸性核酸酶的檢測方法

有效

• 申請號: 201010187567.6
• 申請日: 2010-05-31
• 公開（公告）號: CN101871008A
• 公開（公告）日: 2010-10-27
• 發明（設計）人: 梁新樂
• 申請（專利權）人: 浙江工商大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/44
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 劉曉春

技術領域

本發明涉及真菌酸性核酸酶檢測試劑、制備方法及真菌酸性核酸酶的檢測方法。

背景技術

核酸酶(nucleases)是指所有可以水解核酸的酶。不同來源的核酸酶，其專一性、作用方式都有所不同。有些核酸酶只能作用于RNA，稱為核糖核酸酶(RNase)，有些核酸酶只能作用于DNA，稱為脫氧核糖核酸酶(DNase)，有些核酸酶專一性較低，既能作用于RNA也能作用于DNA，因此統稱為核酸酶(nuclease)。根據核酸酶作用的位置不同，又可將核酸酶分為核酸外切酶(exonuclease)和核酸內切酶(endonuclease)。根據核酸酶的最適作用pH，可將核酸酶分為堿性核酸酶和酸性核酸酶，細菌的核酸酶多為堿性核酸酶(如金黃色葡萄球菌核酸酶)，而真菌的核酸酶多為酸性核酸酶(如桔青霉的核酸酶)。

測定核酸酶的活力一般采用紫外比色法(張樹政.酶制劑工業.科學出版社.1998，749-750.)，該方法比較繁瑣，所需試劑較多，但可以對核酸酶活性進行較準確的定量測定。該方法不能對核酸酶進行快速定性檢測。

采用核酸電泳條帶的彌散，雖然可以部分表觀核酸分子的降解程度(沈鶴柏，夏靜芬，吳慶鋒，余沛濤，章宗穰.Ce離子對寡聚脫氧核苷酸的斷裂作用.上海師范大學學報(自然科學版)，2000，3：67-72)，但不能用于檢測核酸酶。郭良洽(郭良洽，葉芳貴，林旭聰，謝增鴻.甲苯胺藍熒光猝滅法測定核酸.光譜學與光譜分析，2006，No11：121～124；Kui?Jiao，Qing-Jun?Li，Wei?Sun，Zeng-Jian?Wang.Voltammetric?Detection?of?the?DNA?Interaction?with?Toluidine?Blue.Electroanalysis.2005，11：997～1002)等以甲苯胺藍為熒光探針，基于DNA對甲苯胺藍的熒光猝滅作用，建立了一種定量測定DNA的新方法。在pH?8.5的Tris-HCl緩沖溶液中，測定小牛胸腺DNA的線性范圍為0.1-610μg/mL，檢測限為27ng/mL。

對于細菌產生的堿性核酸酶，Steritfeld等(Streitfeld，MM.，Hoffmann?EM，and?Janklow?HM.Evaluation?of?extracellular?deoxyribonuclease?activity?in?Pseudomonas.J.Bacteriol.1962.84：77～80)最早采用甲苯胺蘭O檢測細菌對DNA的水解作用，產生有色沉淀圈來進行判別酶活性的有無。Smith等(Smith，PB，Hancock?GA，and?Rhoden?DL.Improved?medium?for?detectingdeoxyribonuclease-producing?bacteria.Apple.Microbiol.1969，18：991～993)將甲基綠(methylgreen，MG)用于檢測細菌對DNA的水解作用。目前甲苯胺蘭-DNA瓊脂培養基已被用于金黃色葡萄球菌堿性核酸酶的檢測(TNase試驗)中(United?States?Patent?4481291；孟昭赫.食品衛生檢驗方法注解微生物學部分(第一部分)[M].北京：人民衛生出版社，1990.)，用于檢驗樣品中是否存在金黃色葡萄球菌，但對核酸酶活力沒有定量分析。真菌的核酸酶是酸性酶，故上述培養基不能直接用于真菌核酸酶的檢驗測定。

由上述文獻資料可見，采用可用于真菌酸性核酸酶快速檢測、以及定量測定的方法尚未見有報道。

發明內容

本發明首先所要解決的技術問題是提供一種真菌酸性核酸酶檢測試劑，為此，本發明采用以下技術方案：所述試劑為凝膠劑，在液體狀態時，所述試劑的pH＝5.0～6.0，在所述試劑中：

DNA或RNA濃度為0.025～0.125％(g/100mL)；

鋅離子的濃度為1～3×10^-3mol/L、鈣離子的濃度為1.5～2.5×10^-5mol/L；

甲苯胺蘭的濃度為2～4×10^-4mol/L；

瓊脂的含量以所述檢測試劑冷卻后能夠凝固為準。