[發(fā)明專利]嗜熱子囊菌光孢變種61家族內(nèi)切纖維素酶eg基因克隆及其編碼蛋白

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010186704.4
• 申請日: 2010-05-31
• 公開（公告）號: CN101880682A
• 公開（公告）日: 2010-11-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李多川;李安娜;韓華
• 申請（專利權(quán)）人: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/42
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程，具體地說是以嗜熱子囊菌光孢變種Thermoascusaurantiacus?var.levisporus?cDNA為模版，以由原始菌株純化的纖維素酶N端序列及61家族纖維素酶保守位點(diǎn)設(shè)計(jì)兼并引物，擴(kuò)增纖維素酶中間片段，后以3’RACE、5’TAIL-PCR的方法得到內(nèi)切葡聚糖酶eg基因全長cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列。

(二)背景技術(shù)

纖維素是地球上分布最廣、蘊(yùn)藏量最豐富的物質(zhì)，是第一大可再生資源。纖維素的生物降解是通過纖維素酶實(shí)現(xiàn)的。纖維素酶是一個復(fù)合酶系，包括內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶(EC?3.2.1.4)(EG)、β-1，4-纖維二糖水解酶(EC?3.2.1.91)(CBH)及β-1，4-葡萄糖苷酶(EC?3.2.1.21)(BGL)。這三種酶協(xié)同作用，徹底切割β-1，4-糖苷鍵，使纖維素最終降解為葡萄糖。其中內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶是纖維素酶系最主要的成分，它首先作用纖維素，水解纖維素鏈非結(jié)晶區(qū)的β-1，4-糖苷鍵將纖維素鏈打開，它對整個纖維素的降解起重要的作用。纖維素酶屬于糖苷水解酶類，根據(jù)氨基酸序列的同源性以及纖維素酶結(jié)構(gòu)的相似性，將其分成不同的家族，可以反映酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，揭示酶的進(jìn)化關(guān)系，并且可以推斷酶的作用機(jī)理。目前為止，在嗜熱真菌中61家族纖維素酶未見報道，克隆該基因?qū)υ摷易謇w維素酶的催化核心、作用機(jī)制、空間結(jié)構(gòu)等的研究具有重要意義。

纖維素酶廣泛應(yīng)用于輕工、醫(yī)藥、環(huán)保、食品加工、飲料工業(yè)、紡織工業(yè)、可再生資源的綜合利用等方面，被認(rèn)為是最有應(yīng)用潛力的酶制劑之。目前國內(nèi)外纖維素酶主要由嗜溫真菌曲霉和木霉生產(chǎn)，但存在菌種產(chǎn)酶量低、活力低、酶穩(wěn)定性差及成本高等問題，使其纖維素酶的生產(chǎn)和應(yīng)用受到很大限制。由于熱穩(wěn)定纖維素酶在高溫條件下的熱穩(wěn)定，因此具有重要應(yīng)用前景和商業(yè)價值。

嗜熱子囊菌光孢變種Thermoascus?aurantiacus?var.levisporus是一種廣泛分布于土壤中的嗜熱真菌。該菌在微晶纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基中50℃條件下可以產(chǎn)生熱穩(wěn)定的纖維素酶。

(三)發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明從嗜熱子囊菌光孢變種Thermoascus?aurantiacus?var.levisporus獲得內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶基因的全長cDNA序列，命名為eg，eg基因cDNA全長1325bp，包括起始密碼子和多聚A尾，具有一個747bp的開放閱讀框，編碼249個氨基酸。具有信號肽序列(1-21aa?MSFSKIIATAGVLASASLVAG)及一個潛在的N糖基化位點(diǎn)(NNS)。

將eg編碼的氨基酸序列在國際基因庫中進(jìn)行檢索，發(fā)現(xiàn)屬于糖苷水解酶第61家族，其中3個基序GNYV-RHE，GAQNYPQC和Y-IPGP具保守性。

DNAMAN分析其分子量約為26.5Da，等電點(diǎn)約為5.12。Thermoascusaurantiacus?var.levisporus的內(nèi)切葡聚糖酶EG與絲狀真菌亞西島籃狀菌Talaromyces?stipitatus、馬爾尼菲青霉菌penicillium?marneffei的內(nèi)切葡聚糖酶的同源性較高，達(dá)72％。

(四)具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：嗜熱子囊菌光孢變種Thermoascus?aurantiacus?var.levisporus的分離鑒定

(1)標(biāo)本采集：從堆肥中采集。

(2)分離培養(yǎng)：將采集標(biāo)本取0.5克放置在PDA平板上50℃培養(yǎng)3天后，進(jìn)行分離純化。操作步驟參考Cooney?and?Emerson(1964)文獻(xiàn)。

(3)鑒定：參考Cooney?and?Emerson(1964)和LaTouche(1950)文獻(xiàn)。

實(shí)施例2：內(nèi)切-1，4-β-葡聚糖酶基因eg的克隆

(1)嗜熱子囊菌光孢變種Thermoascus?aurantiacus?var.levisporus總RNA的提取：參照Trizol試劑盒說明。