[發(fā)明專(zhuān)利]甘蔗根特異表達(dá)啟動(dòng)子及其用途

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010184834.4
• 申請(qǐng)日: 2010-05-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101948833A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-01-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張樹(shù)珍;王文治;馬滋蔓;楊本鵬;蔡文偉
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/113
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/113;C12N15/82
• 代理公司: 海口翔翔專(zhuān)利事務(wù)有限公司 46001
• 代理人: 莫臻

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)和植物基因工程領(lǐng)域。具體地講，本發(fā)明涉及一種甘蔗根特異表達(dá)的啟動(dòng)子序列，含有該啟動(dòng)子的重組核酸序列，構(gòu)建體和表達(dá)系統(tǒng)，及其驅(qū)動(dòng)功能基因在甘蔗根內(nèi)特異性表達(dá)和優(yōu)先表達(dá)的用途。

技術(shù)背景

在利用基因工程技術(shù)對(duì)農(nóng)作物進(jìn)行遺傳改良的過(guò)程中，人們常常期望插入的外源基因能夠限制在受體特定的組織中表達(dá)。這有兩個(gè)重要的原因：首先，相對(duì)于整體和持續(xù)性表達(dá)而言，限制性表達(dá)(restricted?expression)可減少植株體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)資源新陳代謝的浪費(fèi)，降低對(duì)植株自身原有新陳代謝的影響，降低對(duì)植株生長(zhǎng)的影響；其次，當(dāng)外源表達(dá)蛋白與植株上人或動(dòng)物的食用部位沒(méi)有關(guān)系時(shí)，外源基因最好直接表達(dá)在這些食用部位以外的其他部位中，特別是在人或動(dòng)物攝取外源表達(dá)蛋白的后果還不十分清楚的時(shí)候。而當(dāng)外源表達(dá)蛋白是對(duì)人體或動(dòng)物有益的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)時(shí)，則應(yīng)盡量使外源蛋白在人或動(dòng)物的使用部位高效表達(dá)。

高等植物根的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、組成穩(wěn)定，是研究器官發(fā)生和發(fā)育的良好模式系統(tǒng)，有效的根特異表達(dá)啟動(dòng)子是利用抗病蟲(chóng)基因、抗逆性基因、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收的基因以及促進(jìn)特定次生物質(zhì)代謝的基因等有益目的基因?qū)朕r(nóng)作物并在植物根中驅(qū)動(dòng)表達(dá)的必要前提。

甘蔗是禾本科(Graminaceae)甘蔗屬(SaccharumL.)植物，原產(chǎn)于熱帶、亞熱帶地區(qū)。甘蔗是一種高光效的C4植物，其光飽和點(diǎn)高、二氧化碳補(bǔ)償點(diǎn)低、光呼吸率低、光合強(qiáng)度大、因而生物產(chǎn)量很高，它不僅是一種重要的糖料作物，也是一種重要的能源植物。由于甘蔗是一種宿根植物，主要種植于旱坡地，逆境(特別是干旱和低溫)和各種病蟲(chóng)害對(duì)其生長(zhǎng)影響很大，提高甘蔗對(duì)逆境和病蟲(chóng)的抗性一直是甘蔗育種的主要目標(biāo)之一。研發(fā)甘蔗根特異表達(dá)啟動(dòng)子，對(duì)甘蔗抗病蟲(chóng)、抗逆性等的遺傳改良具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一個(gè)在甘蔗根特異表達(dá)的啟動(dòng)子及其植物表達(dá)載體。本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種甘蔗根特異高效表達(dá)啟動(dòng)子，具有序列表<400>1中的序列。

上述啟動(dòng)子是包括從甘蔗總DNA中克隆的甘蔗己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(PST2a)的啟動(dòng)子，經(jīng)測(cè)序其長(zhǎng)度為1968bp，通過(guò)啟動(dòng)子預(yù)測(cè)(Promoter?predictions)等軟件進(jìn)行基礎(chǔ)啟動(dòng)子的分析，結(jié)果表明該啟動(dòng)子在540-590bp、908-958bp、1575-1625bp、1652-1702bp、1894-1944bp存在五處基礎(chǔ)啟動(dòng)子區(qū)。利用該啟動(dòng)子序列與植物表達(dá)載體pCAMBIA1301構(gòu)建成一個(gè)含有甘蔗己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(PST2a)基因啟動(dòng)子和GUS基因的新的植物表達(dá)載體pCAMBIA1900。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化甘蔗愈傷組織，獲取轉(zhuǎn)基因甘蔗植株，GUS組織化學(xué)染色結(jié)果顯示甘蔗己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(PST2a)基因啟動(dòng)子是一個(gè)根特異性表達(dá)的啟動(dòng)子。

以下我們分為兩部分詳細(xì)介紹我們的發(fā)明內(nèi)容。

一、PST2a基因啟動(dòng)子的克隆及植物表達(dá)載體的構(gòu)建

1.PST2a基因啟動(dòng)子的分離及序列分析

甘蔗基因組DNA提取：采用經(jīng)改良的CTAB法小量提取甘蔗基因組DNA。根據(jù)基因庫(kù)中已登錄的甘蔗己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(PST2a)基因的序列(登錄號(hào)為AY165599.1)，按照染色體步移試劑盒(Universal?GenomeWalker?Kit)的要求設(shè)計(jì)兩條引物：

S1：5’-GCAACAAGAGCAGCTCCCGACATGTTTTC-3’；

S2：5’-GCTCAACGATCCCTGCAACAGCGAGTTAA-3’。

再依據(jù)試劑盒提供的引物、方法及反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增得到一條長(zhǎng)約2000bp的產(chǎn)物，擴(kuò)增片段回收后與pMD-18T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆，交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明其為長(zhǎng)1968bp，序列如序列表中<400>1。通過(guò)啟動(dòng)子預(yù)測(cè)(Promoterpredictions)等軟件進(jìn)行基礎(chǔ)啟動(dòng)子的分析，結(jié)果表明在540-590bp、908-958bp、1575-1625bp、1652-1702bp、1894-1944bp存在五處基礎(chǔ)啟動(dòng)子區(qū)。該啟動(dòng)子具有高等植物啟動(dòng)子應(yīng)具有的調(diào)控元件，如TATA盒、CAAT盒、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)及其他調(diào)控元件(表1)。

表1：PST2a基因啟動(dòng)子元件分析