[發(fā)明專利]一種赤潮藻種快速鑒定的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010184806.2
• 申請日: 2010-05-28
• 公開（公告）號: CN101824481A
• 公開（公告）日: 2010-09-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張濤;甄毓;米鐵柱;于志剛
• 申請（專利權(quán)）人: 中國海洋大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 北京思海天達知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11203
• 代理人: 吳蔭芳

1.一種赤潮藻種快速鑒定的方法，其特征在于，包括以下步驟：

a、實驗藻種f/2及其衍生培養(yǎng)基的配制

b、引物設(shè)計與驗證

c、實驗藻種18S?rDNA片段的獲得

d、PCR優(yōu)化及擴增

e、模擬酶切和實際酶切對照實驗

f、RFLP區(qū)分鑒別赤潮藻種。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述赤潮藻種快速鑒定的方法，其特征在于，所述步驟a為：

f/2微量元素溶液：向950mL重蒸水中加入成分：FeCl3·6H2O，Na2EDTA·2H2O，CuSO4·5H2O，Na2MoO4·2H2O，ZnSO4·7H2O，CoCl2·6H2O，MnCl2·4H2O，定容至1L，高溫滅菌；

f/2維生素溶液：向950mL蒸餾水中加入200mg?vit.B1，加入1ml?vit.H和vit.B12的儲存液，定容至1L，過濾滅菌，置于4℃；

f/2培養(yǎng)基：向950mL蒸餾水中加入成分：NaNO3，NaH2PO4·H2O，Na2SiO3·9H2O，，并定溶至1L，高溫滅菌，儲存于4℃?zhèn)溆茫?/p>

f/2-Si培養(yǎng)基：孔徑為0.22μm的濾膜過濾新鮮海水1L，高溫滅菌，配方同f/2培養(yǎng)基，不加Na2SiO3·9H2O；

f/50培養(yǎng)基：孔徑為0.22μm的濾膜過濾新鮮海水1L，高溫滅菌，冷卻至室溫后中添加40μl營養(yǎng)元素，40μl微量元素溶液，20μl維生素溶液，補充過濾新鮮海水至1L。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述赤潮藻種快速鑒定的方法，其特征在于，所述步驟b為：

(1)實驗藻種目標序列(18S?rDNA)信息的獲得和比對

基于NCBI中的GenBank?DNA序列數(shù)據(jù)庫的相關(guān)信息，獲取實驗藻種的18S?rDNA序列的相關(guān)信息，并運用DNAstar軟件對序列信息進行對比，以搜尋合適的設(shè)計引物的區(qū)域；

(2)實驗藻種目標序列(18S?rDNA)對比和引物的設(shè)計

根據(jù)DNAstar軟件序列對比的結(jié)果，通過Primer?Premier-v軟件對引物相關(guān)條件的設(shè)置，設(shè)計出最優(yōu)引物。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述赤潮藻種快速鑒定的方法，其特征在于，所述步驟c為：

(1)實驗藻種基因組DNA的提取與純化

(2)PCR反應(yīng)

(3)PCR的優(yōu)化

選取18S?rDNA序列，設(shè)計出引物1、引物2、引物3，其序列為：

引物1：18S(R)：AACCTGGTTGATCCTGCCAGT

18S(F)：TGATCCTTCTGGAGGTTCACCTAC

引物2：18S?rDNA(R)：TGTCTCAAAGATTAAGCCATG

18S?rDNA(F)：ACTTCTCCTTCCTCTAAGTGA

引物3：18S?rDNA(1)：ACCTGGTTGATCCTGCCAGT

18S?rDNA(2)：TCACCTACGGAAACCTTGT。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述赤潮藻種快速鑒定的方法，其特征在于，所述步驟d為：

(1)PCR反應(yīng)中Mg2+的濃度的優(yōu)化

(2)PCR反應(yīng)中模板起始濃度的優(yōu)化

(3)PCR反應(yīng)中引物起始濃度的優(yōu)化

然后進行PCR擴增。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述赤潮藻種快速鑒定的方法，其特征在于，所述步驟e為：將實驗藻種序列信息錄入excel軟件，并結(jié)合實驗用到的限制性內(nèi)切酶的酶切信息，通過excel軟件，作出酶切片段數(shù)和長度的信息，建立初級酶切信息數(shù)據(jù)表；

根據(jù)模擬數(shù)據(jù)表建立的信息，進行篩選，從中挑選出限制性內(nèi)切酶，運用Vector?NTI?Suite?9軟件確定凝膠電泳的條件，然后對實驗藻種序列進行模擬的酶切，并跑出模擬電泳圖，根據(jù)此初步判斷其區(qū)分鑒別程度；

選取部分實驗藻種進行酶切實驗，并與的模擬實驗結(jié)果進行比對，驗證模擬實驗和實際試驗的吻合程度，其中，

反應(yīng)體系為：總體積30μl，其中18S?rDNA擴增產(chǎn)物15μl，酶切反應(yīng)緩沖液5μl，內(nèi)切酶3μl，滅菌重蒸水7μl；

反應(yīng)時間為：65℃條件下90min，其酶切產(chǎn)物也用凝膠電泳檢測，瓊脂糖凝膠濃度為1％，電壓100V，電泳30min，然后在凝膠成像系統(tǒng)中進行分析。