[發(fā)明專利]啟動子AFB4及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010183227.6
• 申請日: 2010-05-19
• 公開（公告）號: CN101831431A
• 公開（公告）日: 2010-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王秀杰;王猛;儲成才;曹守云
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/11;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10;A01H5/00
• 代理公司: 北京紀凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;任鳳華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及啟動子AFB4及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

啟動子按其作用方式和功能可以分為三類：組成型啟動子、誘導(dǎo)型啟動子和組織特異性啟動子。組成型啟動子在所有組織中都能啟動表達，有表達的持續(xù)性，沒有時空特異性，如CaMV35S啟動子等。該類啟動子得到了大量研究和應(yīng)用，在基因工程中發(fā)揮重要作用。但由于其表達不分時空，會導(dǎo)致外緣基因表達的過量積累，會影響植物正常的生長發(fā)育。因此，尋找誘導(dǎo)型或組織特異性的啟動子，對于基因功能研究和轉(zhuǎn)基因育種都具有重要作用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個目的是提供一種具有特異表達啟動子功能的DNA片段。

本發(fā)明所提供的DNA片段，為如下1)、2)或3)所示：

1)序列表中序列1所示的DNA片段；

2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA片段；

3)與1)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且具有相同功能的DNA片段。

擴增上述任一所述DNA片段全長或其任意片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍。

所述引物對中，一條引物序列如序列表中序列2所示，另一條引物序列如序列表中序列3所示。

含有上述任一所述DNA片段的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細胞系或表達盒也屬于本發(fā)明的保護范圍。

上述任一所述DNA片段在使目的基因在植物的側(cè)根產(chǎn)生處和/或植物的葉鋸齒邊緣處表達中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。

上述應(yīng)用中，所述側(cè)根產(chǎn)生處為主根與側(cè)根結(jié)合的維管柱處。

上述應(yīng)用中，所述植物為雙子葉植物。

上述應(yīng)用中，所述雙子葉植物為擬南芥。

上述任一所述DNA片段在植物的遺傳育種中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。

上述應(yīng)用中，所述植物為雙子葉植物；所述雙子葉植物為擬南芥。

實驗證明，本發(fā)明的AFB4?DNA片段是一啟動子，且該啟動子有很強的特異表達活性，特異的在植物的側(cè)根產(chǎn)生處(主根與側(cè)根結(jié)合的維管柱處)和葉的鋸齒邊緣處表達。本發(fā)明啟動子為特異表達的基因功能研究和植物的轉(zhuǎn)基因育種提供了有利工具，具有重要意義。

附圖說明

圖1為PCR擴增得到AFB4的啟動子。

圖2為表達載體的酶切鑒定。

圖3為P-AFB4-1391-GUS載體示意圖。

圖4為轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR鑒定。

圖5為AFB4啟動子的GUS活性。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1、啟動子的制備及特異表達驗證

一、啟動子的制備及確認

1、擬南芥基因組DNA的提取

(1)取擬南芥葉片，加入液氮，充分研磨后，將粉末倒入1.5ml離心管中；

(2)待離心管中液氮揮發(fā)完全后，立即加入500ul?DNA提取緩沖液(0.1mol/LTris·HCl(pH?8.0)，0.5mol/L?NaCl，0.05mol/L?EDTA，0.5％SDS)，充分混勻后，65℃保溫30分鐘，期間不斷溫和上下顛倒離心管，使樣品與緩沖液充分混合；

(3)以12,000rpm室溫離心15分鐘；

(4)將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管；

(5)加入等體積tris-酚，抽提一遍；

(6)再用等體積的氯仿抽提一遍；

(7)取上清，加入等體積異丙醇，輕柔晃動離心管，使異丙醇與上清液充分混勻，-20靜置10分鐘，以12,000rpm離心10分鐘；

(8)用70％的乙醇洗劑，DNA沉淀在超凈工作臺吹干后，用滅菌雙蒸水溶解備用。

2、PCR擴增

以擬南芥基因組DNA為模板，用引物對P1和P2進行PCR擴增。

引物序列如下：

P1：ACTGCAGCTGACTCACTAAGTCGTCCAT(序列2)，

P2：TGGATCCCTCTGACTTTGATCTTATCCA(序列3)，

反應(yīng)體系如下：

PCR程序：

將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)果如圖1所示(M：Marker；-：PCR空白對照；P：PCR擴增產(chǎn)物)?；厥漳康臈l帶。