[發明專利]一種新的β-1,6-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1及其應用

無效

• 申請號: 201010182672.0
• 申請日: 2010-05-26
• 公開（公告）號: CN102260658A
• 公開（公告）日: 2011-11-30
• 發明（設計）人: 于文功;趙志全;韓峰;張貴民;譚玉龍;劉忠
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學;魯南制藥集團股份有限公司
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N1/20
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及生物技術領域。具體地，本發明涉及一種新的β-1，6-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1及其應用。?

背景技術

生物被膜(biofilm)是由細菌和其分泌的胞外基質在物體表面形成的高度組織化的多細胞結構。一旦形成生物被膜，細菌將具有極強的抗生素耐藥性(比浮游細菌高100-1000倍)和逃避機體免疫系統攻擊的能力。牙菌斑生物被膜是牙周病的始動因素，在牙菌斑生物被膜的刺激下，牙周組織細胞分泌的細胞因子在牙槽骨吸收及牙周軟組織破壞的過程中發揮著重要作用。然而，目前絕大多數研究集中在浮游細菌對牙周組織細胞毒性的研究，而關于細菌生物被膜與牙周病的研究極少。伴放線放線桿菌是侵襲性牙周炎的主要致病菌，它產生的β-1，6-N-乙酰葡聚糖胺是其生物被膜的主要成份，在生物被膜形成和致病性方面發揮著重要作用。但目前尚未有能降解β-1，6-N-乙酰葡聚糖胺的β-1，6-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶被發現。本發明的發明人從海洋微生物中發現了一種β-1，6-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1，能降解β-1，6-N-乙酰葡聚糖胺，并具有抗伴放線放線桿菌生物被膜的作用。?

發明內容

本發明的目的之一是提供一種N-乙酰氨基葡萄糖苷酶。?

本發明的另一目的是提供一種上述酶在抗伴放線放線桿菌生物被膜中的應用。?

根據本發明的一個技術方案，從海洋微生物中純化得到一種新的產N-乙酰氨基葡萄糖苷酶。?

根據本發明的另一技術方案，使用上述酶對伴放線放線桿菌生物被膜形成進行了抑制，對已形成生物被膜進行了清除。?

本發明的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1對伴放線放線桿菌生物被膜形成的抑制作用＞50％，對已形成生物被膜的清除率為74.5％。?

具體實施方式

實施例1菌株的分離和發酵條件?

從黃海采集海泥，樣品置于無菌塑料瓶，4℃保存，4h以內用如下方法處理：1mL海泥，加4mL無菌海水，取其懸浮液稀釋接入選擇性培養基中富集培養。一周后劃線于固體培養基培養，經過連續5代挑取單克隆純化培養后，挑取單克隆接種到含3毫升液體培養基的試管中，25℃200r/min培養12小時。將培養液按1％的比例接入發酵培養基，于25℃150r/min培養3d。4℃12000對min離心10min去除菌體，測定上清液的酶活力，選取酶活力最高的菌株。其中菌株QY403產生的酶活力最高，為4.65U/mL。培養基配方為：每升含β-1，6-N-乙酰葡聚糖胺3g、KH₂PO₄3g、K₂HPO₄·3H₂O?7g、(NH₄)₂SO₄?2g、NaCl?30g、MgSO₄·7H₂O?11g、FeSO₄·7H₂O?11g，pH?6.0，100kP滅菌15min。固體培養基中添加1.5％瓊脂。酶活力測定方法：200μl底物(1.71g/L?4-硝基苯基-N-乙酰葡聚糖胺)中，加入5μl的酶，40℃保溫5分鐘，再加入5μl?10M的NaOH中止反應，以0min處底物溶液為空白。迅速測定反應體系在405nm的光吸收值(OD405)。酶活力單位(U)定義為：在以上條件下，每分鐘產生1μmol的產物的酶量，定義為1個U。?

實施例2N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1的分離純化?

(1)細菌培養?

挑QY403單克隆入5ml培養基，25℃150r/min過夜。轉接裝有100mL培養基的500mL搖瓶(1％接種量)，25℃150r/min振蕩培養72小時。4℃離心10000rpm，15分鐘，收集細菌發酵液上清液。?

(2)硫酸銨沉淀粗分離?

發酵液上清中緩慢加入硫酸銨至80％飽和度，4℃靜置3h；40℃12000g離心30min，棄去上清液，沉淀溶于20mmol/LpH7.5磷酸鹽緩沖液，對同樣的緩沖液4℃透析過夜；40℃13000g離心30min取上清液，即為粗酶液。?

(3)離子交換層析?