[發(fā)明專(zhuān)利]維持干細(xì)胞自我更新的6個(gè)豬源關(guān)鍵基因的體外轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒的構(gòu)建

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010182404.9
• 申請(qǐng)日: 2010-05-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101984062A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-03-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 歐陽(yáng)紅生;唐小春;逄大欣;周楊;朱建國(guó);賴(lài)良學(xué);陳月;段新平;張明軍
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 吉林大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/66
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/66;C12N15/12;C12N15/63;C12N5/10
• 代理公司: 吉林長(zhǎng)春新紀(jì)元專(zhuān)利代理有限責(zé)任公司 22100
• 代理人: 王薇

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明利用基因工程技術(shù)，構(gòu)建了體外轉(zhuǎn)錄載體及能夠誘導(dǎo)豬胚胎成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變成豬多能干細(xì)胞的6個(gè)關(guān)鍵基因的體外轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，用于誘導(dǎo)豬的成纖維細(xì)胞成豬多能干細(xì)胞，為建立人類(lèi)疾病模型提供了基本條件，該發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

豬是最適合人類(lèi)器官移植和建立人類(lèi)疾病模型的動(dòng)物，但豬的疾病模型大多數(shù)用基因敲除技術(shù)得到基因敲除的體細(xì)胞然后利用核移植的技術(shù)產(chǎn)生可繼續(xù)發(fā)育的卵母細(xì)胞，從而得到基因敲除豬。但在這個(gè)過(guò)程中存在基因敲除效率低，孕期流產(chǎn)率高，初生仔豬有缺陷等問(wèn)題；此外，豬的干細(xì)胞分離至今沒(méi)有成功，所以根據(jù)Yamanaka研究小組的實(shí)驗(yàn)方法，在成纖維細(xì)胞中轉(zhuǎn)入幾個(gè)干細(xì)胞的關(guān)鍵基因就能將成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變成多能干細(xì)胞。目前，利用脂質(zhì)體等轉(zhuǎn)染試劑對(duì)成纖維細(xì)胞的多基因轉(zhuǎn)染效率非常低，導(dǎo)致轉(zhuǎn)入的基因量不同，但用逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶基因用其感染成纖維細(xì)胞的方法得到的基因敲除豬又存在生物安全性的問(wèn)題。因此，我們?cè)噲D在體外大量轉(zhuǎn)錄維持干細(xì)胞自我更新的豬的6個(gè)關(guān)鍵基因，然后將其mRNA轉(zhuǎn)入豬胚胎成纖維細(xì)胞后使其變成豬的多能干細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的之一是構(gòu)建基因體外轉(zhuǎn)錄載體，該載體可以對(duì)某個(gè)基因進(jìn)行大量的體外轉(zhuǎn)錄，得到可高效翻譯的mRNA。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是構(gòu)建了攜帶維持干細(xì)胞自我更新的豬的6個(gè)關(guān)鍵基因和對(duì)照基因EGFP的體外轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，這6個(gè)基因體外轉(zhuǎn)錄出的mRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)豬胚胎成纖維細(xì)胞后能夠使其轉(zhuǎn)變成豬的多能干細(xì)胞；并用細(xì)胞水平通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染鑒定了體外轉(zhuǎn)錄mRNA的功能。

本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：維持干細(xì)胞自我更新的6個(gè)豬源關(guān)鍵基因的體外轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒的構(gòu)建，其特征在于具體制備方法如下：

首先設(shè)計(jì)基因體外轉(zhuǎn)錄空載體Vitro-TransPMD-18T，然后獲得EGFP和維持干細(xì)胞自我更新的豬源的6個(gè)關(guān)鍵基因的cDNA，再按相應(yīng)的酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切連接，并用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)7個(gè)體外轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，得到相應(yīng)的mRNA，然后將Vitro-Trans-EGFP轉(zhuǎn)染進(jìn)豬胚胎成纖維細(xì)胞，檢測(cè)其功能；

1、基因體外轉(zhuǎn)錄載體的構(gòu)建

用重疊延伸PCR的方法得到104bp的序列，包括T7啟動(dòng)子，增強(qiáng)翻譯效率的minusCT，包含ATG起始密碼子的5’UTR和一段包含酶切位點(diǎn)的無(wú)關(guān)序列。然后連接進(jìn)入PMD-18T?simple載體，用于以后表達(dá)基因的插入。

根據(jù)目的序列設(shè)計(jì)2對(duì)引物，P1，P2；P3，P4。用引物P1和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到60bp的序列，電泳，切膠回收，然后以60bp的產(chǎn)物為模板用引物P3和P4進(jìn)行PCR，得到104bp的反轉(zhuǎn)錄模板序列。

表1引物序列

??引物??核苷酸序列??P1??5′-tatagggagaagagggagagtagagccgccaccat?3′??P2??5′-attctccgcggacatatgtgggcccatggtggcgg3′??P3??5′-Ctcgaggactaatacgactcactataggga?3′??P4??5′-aagcttgctagctctcgagagaattctccg?3′

根據(jù)PMD-18T?simple載體的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄模板序列與骨架載體的連接。然后用酶切方法證明了體外轉(zhuǎn)錄載體的正確構(gòu)建。

2、維持干細(xì)胞自我更新的豬源關(guān)鍵基因的cDNA的獲得