[發(fā)明專利]生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010181385.8
• 申請日: 2010-05-25
• 公開（公告）號: CN101906408A
• 公開（公告）日: 2010-12-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉守信;李軍章;甄小麗;田霞;明常鑫
• 申請（專利權(quán)）人: 河北科技大學(xué)
• 主分類號: C12N9/78
• 分類號: C12N9/78;C12P13/04;C12R1/01;C12R1/06
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1.生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑，其特征是，它由產(chǎn)海因酶的黃金節(jié)桿菌的活化細(xì)胞和產(chǎn)氨甲酰水解酶的放射形土壤桿菌的活化細(xì)胞組成。

2.如權(quán)利要求1所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑，其特征是，所述黃金節(jié)桿菌產(chǎn)生的海因酶的初始酶活性為大于0.32U，所述放射形土壤桿菌產(chǎn)生的氨甲酰水解酶的初始的活性大于10U。

3.如權(quán)利要求1所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑，其特征是，所述黃金節(jié)桿菌的初始海因酶活性為0.32U～0.45U。

4.如權(quán)利要求1所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑，其特征是，所述黃金節(jié)桿菌為黃金節(jié)桿菌3256活化細(xì)胞，所述放射形土壤桿菌為放射形土壤桿菌3255活化細(xì)胞。

5.如權(quán)利要求1～4所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑的制備方法，其特征是它包括以下步驟：

a.將產(chǎn)海因酶的黃金節(jié)桿菌接種于含玉米漿、糖蜜、氫氧化鈉水溶液、氯化鈉、2-硫尿嘧啶、硫酸鎂、硫酸錳和磷酸氫二銨的液體培養(yǎng)基中，于30～34℃攪拌活化培養(yǎng)，其中，攪拌速度為60rpm；活化時間為12～18h，優(yōu)選14～16h；空氣壓力為0.18～0.23Mpa，優(yōu)選為0.2Mpa；空氣流量為20～26L/h；反應(yīng)釜壓力為0.04～0.06Mpa，優(yōu)選為0.05Mpa；然后將該培養(yǎng)液用水溶性殼聚糖絮凝，過濾收獲固形酶制劑1；

所述液體培養(yǎng)基含玉米漿360～460重量份、糖蜜380～480重量份、濃度為25～35％(w/w)的氫氧化鈉水溶液15～25重量份、氯化鈉40～60重量份、2-硫尿嘧啶27～37重量份硫酸鎂8～10重量份、硫酸錳1.2～1.8重量份、和磷酸氫二銨3～4重量份，并加水定容至8000重量份；

b.將產(chǎn)氨甲酰水解酶的放射形土壤桿菌接種于含玉米漿、葡萄糖、蛋白胨、氯化鈉、硫酸錳、磷酸氫二銨和阿拉伯糖的液體培養(yǎng)基中，于32～38℃攪拌活化培養(yǎng)，其中攪拌速度為60rpm；活化時間為15～22h，優(yōu)選16～18h，最優(yōu)選為17h；空氣壓力為0.18～0.23Mpa，優(yōu)選為0.2Mpa；空氣流量為18～22L/h；反應(yīng)釜壓力為0.04～0.06Mpa，優(yōu)選為0.05Mpa；在所述培養(yǎng)基中添加氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為6.5～7.8，優(yōu)選為6.8～7.3，最優(yōu)選為7.0，然后將該培養(yǎng)液用水溶性殼聚糖絮凝，過濾收獲固形酶制劑2；

所述液體培養(yǎng)基含玉米漿200～400重量份、葡萄糖180～260重量份、蛋白胨80～100重量份、25g氯化鈉20～30重量份、硫酸錳1.6～2.0重量份、磷酸氫二銨6.8～7.6重量份、和阿拉伯糖12～16重量份；并將所述液體培養(yǎng)基加水定容至8000重量份；

c.將步驟a制得的固形酶制劑1和步驟b制得的固形酶制劑2混合，制得生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑，其中所述固形酶制劑1和所述固形酶制劑2的重量配比為1～5∶1～50，優(yōu)選比例為1～5∶1～20，更優(yōu)選比例為1～2∶1～5。

6.如權(quán)利要求1所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑，其特征是，它用于酶催化非均相水解海因合成D-芳基甘氨酸的方法中。

7.如權(quán)利要求6所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑，其特征是，所述的酶催化非均相水解海因合成D-芳基甘氨酸的方法包括以下步驟：

①在酶催化反應(yīng)罐中，加入水和5-芳基海因，并調(diào)整pH值為6.5～7.8，5-芳基海因的加入量占水和5-芳基海因總重量的5～21％(w/w)，得混合溶液；

②在攪拌的條件下向酶催化反應(yīng)罐中加入權(quán)利要求1～5任一所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑，在25～40℃下攪拌反應(yīng)，直至無法檢測出5-芳基海因，制得D-芳基甘氨酸；

其中所述生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑占步驟①中的混合溶液的總重量的1～10％，優(yōu)選為為2-8％；反應(yīng)時間8～66小時；

③通過200目篩分離沉淀出D-芳基甘氨酸固體，經(jīng)過重結(jié)晶，獲得D-芳基甘氨酸晶體；

④通過超濾膜過濾和蒸發(fā)濃縮來提取酶催化反應(yīng)罐中的液體中溶解的D-芳基甘氨酸，再經(jīng)過重結(jié)晶，得D-芳基甘氨酸晶體。