[發(fā)明專(zhuān)利]一種檢測(cè)無(wú)鱗魚(yú)致病菌溫和氣單胞菌的方法和檢測(cè)試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010180810.1
• 申請(qǐng)日: 2010-05-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102002523A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-04-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃冠軍;肖丹;劉衍鵬;康琦
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 通威股份有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12R1/01
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種魚(yú)類(lèi)致病菌的檢測(cè)技術(shù)，特別是無(wú)鱗魚(yú)致病菌溫和氣單胞菌的檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒以及相應(yīng)的引物。

背景技術(shù)

隨著大口鯰、斑點(diǎn)叉尾鮰等名貴經(jīng)濟(jì)無(wú)鱗魚(yú)的高密度養(yǎng)殖，細(xì)菌性疾病的發(fā)生日益嚴(yán)重，特別是苗種階段尤其明顯。因此，只有不斷地完善防治方法，認(rèn)真貫徹“全面預(yù)防，積極治療”的方針，才能收到預(yù)期的防病效果。預(yù)防疾病的一個(gè)重要基礎(chǔ)是判斷養(yǎng)殖水體中或魚(yú)體內(nèi)中是否存在某些特定的魚(yú)類(lèi)致病菌以及已經(jīng)存在的致病菌的種類(lèi)和數(shù)量，從而才能夠采取合適的方法對(duì)癥下藥。因此，如何快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)和判斷某些細(xì)菌的感染，以有助于闡明其致病機(jī)理，及時(shí)治療和控制魚(yú)病的發(fā)生，一直就是眾人所努力攻克的難題。

目前，針對(duì)致病菌的檢測(cè)和診斷技術(shù)多種多樣，包括選擇性培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(DOT-ELISA)、單克隆抗體技術(shù)(Monoclonal?Antibody?Technique)等。這些方法各有其特點(diǎn)，但在生產(chǎn)應(yīng)用中多表現(xiàn)出培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)、只能用于粗略檢測(cè)，不甚精確、敏感性和特異性差等不足。而在檢測(cè)和診斷技術(shù)中，聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChain?Reaction，PCR)因其具有的簡(jiǎn)便、快速、敏感、特異、適于早期和大量樣品檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，已在該研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。但是對(duì)于無(wú)鱗魚(yú)中斑點(diǎn)叉尾鮰和大口鯰主要致病菌柱狀黃桿菌和溫和氣單胞菌，目前國(guó)內(nèi)尚沒(méi)有相關(guān)的PCR檢測(cè)技術(shù)方面的研究報(bào)告。

為了及時(shí)監(jiān)控?zé)o鱗魚(yú)養(yǎng)殖中的魚(yú)病發(fā)生，迫切需要一種能快速檢測(cè)魚(yú)體內(nèi)或養(yǎng)殖水體中是否存在致病菌的技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一是提供一種檢測(cè)無(wú)鱗魚(yú)致病菌的試劑盒，包含引物B，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1-2所示，擴(kuò)增來(lái)自溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)的基因。

所述試劑盒還含有如SEQ?ID?NO：3所示核苷酸序列的陽(yáng)性對(duì)照物。

本發(fā)明的另一目的是提供一種檢測(cè)無(wú)鱗魚(yú)致病菌的方法，包括以下步驟：

1)提取待檢樣本中的DNA；

2)用引物對(duì)樣本中的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，所述引物的核苷酸序列如SEQ?IDNO：1～2所示；

3)用SEQ?ID?NO：3所示的核苷酸序列制備標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板，并進(jìn)行稀釋和定量；

4)對(duì)DNA擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。

本發(fā)明方法步驟1)所述的待測(cè)樣本取自魚(yú)體或養(yǎng)殖水體。

本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種選自如SEQ?ID?NO：1～2所示寡核苷酸序列的用途，其用于擴(kuò)增或檢測(cè)來(lái)自溫和氣單胞菌的基因。

附圖說(shuō)明

圖1溫和氣單胞菌常規(guī)PCR測(cè)試引物及檢測(cè)體系

11-19：引物對(duì)AS1F/AS1R，11-13為空白對(duì)照；

21-29：引物對(duì)AS2F/AS2R，21-23為空白對(duì)照；

31-39：引物對(duì)AS3F/AS3R，31-33為空白對(duì)照；M：DNA?marker?I.

圖2溫和氣單胞菌常規(guī)PCR檢測(cè)體系的特異性

1-2：空白對(duì)照；3：豚鼠氣單胞菌ATCC?15468；4：嗜水氣單胞菌；5：熒光假單胞菌；6：河弧菌；7：柱狀黃桿菌；8-9：溫和氣單胞菌；M：DNA?markerI.

圖3溫和氣單胞菌常規(guī)PCR檢測(cè)體系的靈敏度

1-7：基因組DNA從50納克到50菲克的10倍梯度稀釋?zhuān)?：空白對(duì)照；M：DNA?marker?I.

圖4草魚(yú)樣品檢測(cè)結(jié)果(溫和氣單胞菌)

1：空白對(duì)照；2-14：魚(yú)池采集的樣品；15：陽(yáng)性對(duì)照；M：DNA?marker?I.

圖5鯉魚(yú)樣品檢測(cè)結(jié)果(溫和氣單胞菌)

1：空白對(duì)照；2-8：待檢測(cè)樣品；9：陽(yáng)性對(duì)照；M：DNA?marker?I.

圖6水體中溫和氣單胞菌檢測(cè)結(jié)果

1：空白對(duì)照；2-5：待測(cè)水樣，6：陽(yáng)性對(duì)照；M：DNA?marker?I

具體實(shí)施方式

根據(jù)已有文獻(xiàn)資料報(bào)道，溫和氣單胞菌為常見(jiàn)的魚(yú)類(lèi)致病菌，在養(yǎng)殖無(wú)鱗魚(yú)的發(fā)病魚(yú)體和養(yǎng)殖水體中常常存在，因此，我們選取溫和氣單胞菌作為研究靶標(biāo)，以PCR作為技術(shù)手段，以這些菌株的保守毒力基因序列作為靶標(biāo)序列，研究和建立PCR快速檢測(cè)技術(shù)體系，從基因水平上，通過(guò)多學(xué)科的聯(lián)合研究，在魚(yú)致病性細(xì)菌的早期、快速、定量檢測(cè)方面進(jìn)行一些積極的探索，加強(qiáng)魚(yú)病的預(yù)防和診斷。

以下實(shí)施例是為了對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，并非對(duì)發(fā)明的限制。