[發明專利]一種利用流式細胞儀檢測腹腔吞噬細胞活性的方法

無效

• 申請號: 201010180339.6
• 申請日: 2010-05-24
• 公開（公告）號: CN101846626A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發明（設計）人: 陳慶森;李偉;閻亞麗
• 申請（專利權）人: 天津商業大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N1/28;C12Q1/02
• 代理公司: 天津市三利專利商標代理有限公司 12107
• 代理人: 肖莉麗

1.一種利用流式細胞儀檢測腹腔吞噬細胞活性的方法，其特征在于，包括下述步驟：

(1)制備啤酒酵母細胞凍干粉：利用土豆培養基培養啤酒酵母細胞，并將獲得的啤酒酵母細胞溶液通過冷凍干燥制成啤酒酵母細胞凍干粉；

(2)利用FITC標記啤酒酵母細胞：將FITC與二甲亞砜按照1mg∶200μl的比例溶解，然后與pH值為9.5、濃度為0.5M的碳酸緩沖液混合配制成濃度為0.1mg/ml的FITC溶液備用；將步驟(1)中得到的啤酒酵母細胞凍干粉與pH值為7.2、濃度為0.01M的PBS緩沖液按20mg∶1ml的比例混勻后，80℃滅活15min；滅活后離心，棄上清液取沉淀；將得到的沉淀物與上述備用的0.1mg/ml的FITC溶液混勻，室溫避光孵育1h對啤酒酵母細胞進行熒光標記，其中，0.1mg/ml的FITC溶液的用量為與步驟(1)中得到的啤酒酵母凍干粉的比例為1ml∶20mg；將上述熒光標記后的溶液用pH值為7.2、濃度為0.01M的PBS緩沖液離心洗滌，直至上清液無色透亮；離心，棄上清液取沉淀得到熒光標記的啤酒酵母細胞；檢測熒光標記率，調整最終熒光標記率合格的熒光標記啤酒酵母細胞懸液，其熒光標記啤酒酵母細胞濃度為2×10⁹個/ml于4℃冰箱中保存備用；

(3)將步驟(2)中得到的備用的熒光標記啤酒酵母細胞的懸液與小鼠血清按照體積比為1∶1的比例室溫孵育60min，用pH值為7.2、濃度為0.01M的PBS緩沖液調整熒光標記啤酒酵母細胞濃度為1×10⁹個/ml；

(4)將吞噬細胞的個數至少為1×10⁶個/ml的腹腔吞噬細胞懸液加入培養板的一個孔中作為陰性對照；將步驟(3)中得到的與小鼠血清孵育后的熒光標記啤酒酵母細胞的懸液與同樣的上述吞噬細胞的個數至少為1×10⁶個/ml的腹腔吞噬細胞懸液加入到細胞培養板中其余的孔中，按照吞噬細胞和熒光標記的啤酒酵母細胞個數比為1∶20的比例混合；然后將細胞培養板置于37℃培養箱中貼壁孵育40min，用4℃pH值為7.2、濃度為0.01M的PBS緩沖液沖洗除去細胞培養板中多余的啤酒酵母細胞和沒有貼壁的腹腔吞噬細胞，最后，在培養板除陰性對照孔外的各孔中加入4℃的0.5mlpH值為7.2、濃度為0.01M的PBS緩沖液混勻，獲得吞噬熒光啤酒酵母細胞的腹腔吞噬細胞懸液，用移液槍將其轉移至流式管中，將流式管置于冰上，待上流式細胞儀檢測；

(5)利用流式細胞儀對步驟(2)中備用的熒光標記啤酒酵母細胞懸液和步驟(4)中得到的吞噬熒光啤酒酵母細胞的腹腔吞噬細胞懸液樣本進行檢測，獲取數據并對數據進行分析：①取步驟(4)中沒有加熒光啤酒酵母細胞的腹腔吞噬細胞懸液作為陰性對照進行上樣，通過調整FL1熒光通道電壓，使腹腔吞噬細胞群體峰的位置位于熒光電壓橫軸左側，并對腹腔吞噬細胞進行獲取；②在流式細胞儀各熒光電壓參數和閾值保持不變的情況下，利用流式細胞儀測得步驟(2)中備用的熒光標記的啤酒酵母細胞的平均熒光強度，并以此熒光強度作為標準；③取步驟(4)中獲得的吞噬熒光啤酒酵母細胞的腹腔吞噬細胞懸液進行上樣，在流式細胞儀各參數保持不變的情況下，利用流式細胞儀對流式管中的腹腔吞噬細胞樣本進行細胞獲取；④利用BD?CellQuest?Pro數據分析軟件對獲取的腹腔吞噬細胞數據進行分析，先畫散點圖，通過前向光和側向光，圈住腹腔吞噬細胞群體區域，然后畫柱狀圖對陰性區域設門M1；將步驟②的熒光標記的啤酒酵母細胞的平均熒光強度設為一個標準單位，對步驟③得到的細胞獲取結果按照標準單位的倍數進行設門，從門M1的右端至一個標準單位的位置為M2，在2倍、3倍......、n-1倍標準單位處設門依次分別為M3、M4......Mn，其中：M1代表M1門內的腹腔吞噬細胞數，即陰性腹腔吞噬細胞群體，為沒有吞噬啤酒酵母細胞的腹腔吞噬細胞總數；M2代表M2門內的腹腔吞噬細胞總數，即吞噬1個酵母細胞的腹腔吞噬細胞個數；Mn代表Mn門內的腹腔吞噬細胞個數，即吞噬n-1個酵母細胞的腹腔吞噬細胞個數；

根據設門的個數來確定n的值，對門內細胞進行分析，分別得到M1、M2、M3......Mn門內的腹腔吞噬細胞個數和M1門內腹腔吞噬細胞占總吞噬細胞的百分率，按照下列兩個公式分別計算吞噬細胞的吞噬率和吞噬指數：

吞噬率(％)＝吞噬啤酒酵母細胞的吞噬細胞數/獲取的吞噬細胞總數＝1-M1門內吞噬細胞占總吞噬細胞的百分率；

吞噬指數＝被吞噬的酵母細胞總數/獲取的吞噬細胞總數＝[M2+2M3+3M4+......+(n-1)Mn]/獲取的吞噬細胞總數。