[發明專利]一種同時測定多種抗HIV藥物血漿濃度方法

無效

• 申請號: 201010179984.6
• 申請日: 2010-05-21
• 公開（公告）號: CN102253129A
• 公開（公告）日: 2011-11-23
• 發明（設計）人: 張麗軍;盧洪洲;姚亞敏
• 申請（專利權）人: 上海市公共衛生臨床中心
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/14;G01N30/72
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 吳桂琴

技術領域

本發明屬于醫學檢驗領域，涉及體內藥物的分析測定方法。具體涉及一種可同時測定多種抗HIV藥物血漿濃度方法。

背景技術

艾滋病，即獲得性免疫缺陷綜合征(acquired?immunodeficiency?syndrome，AIDS)于1981年美國報道首例后開始在世界范圍內迅速蔓延。其后的一段時間由于缺乏有效的治療手段而存在著很高的病死率，在高效抗反轉錄病毒聯合治療(high?activeantiretroviral?therapy，HAART)的方案提出后，艾滋病的發病率和病死率有了明顯下降。毋庸置疑，HAART的出現是艾滋病治療史上一個重要的里程碑，通過這種治療方案，可將患者體內的HIV載量控制在現有檢測方法無法檢測的水平(＜50copies/ml)，從而延緩HIV(human?inmunodeficiency?virus)感染的臨床進程，重建機體的免疫功能，改善患者預后，提高患者生存質量。但目前，幾乎所有的抗反轉錄病毒藥物均會引起相應的不良反應(adverse?reaction，AR)，這也是患者改變抗病毒治療方案和停藥的主要原因。此外，抗反轉錄病毒藥物也常會在臨床使用一段時間后發生耐藥，進而導致治療失敗，此現象多與血漿抗反轉錄病毒藥物濃度水平相關。作為國內常用的非核苷類反轉錄酶抑制劑之一的依非韋倫，其半衰期長(40-55小時)，患者每天服用一次即可有效抑制HIV復制，也有利于保持臨床治療用藥的依從性。但在臨床實踐中，發現不少患者服用EFV后可能出現血漿藥物濃度偏低而誘使HIV產生耐藥。已有的研究表明，當EFV血漿藥物濃度低于1mg/L時，治療失敗的概率要顯著高于血漿EFV濃度在1mg/L以上的患者。而將EFV治療濃度的下限值提升至2mg/L可獲得比1mg/L更高的治療有效應答率。對于我國而言，由于目前國內抗艾滋病藥物均來自國外，相應的藥物代謝動力學參數以國外人群如高加索人種為主進行研究，而群體遺傳基因組學研究表明，國內人群CYP2B6單核苷酸多態性與國外存在較大差異。因為CYP2B6是EFV代謝的主要細胞色素P450酶系統成分，所以，我國人群EFV藥物代謝水平可能不同于國外，國內患者服用EFV的不良反應以及臨床療效與血藥濃度之間的關系有待進一步研究。

高效液相色譜(High?Performance?Liquid?Chromatography，HPLC)是以液體為流動相，采用高壓輸液系統，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各待檢測成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現對待分析物的檢測。質譜分析是一種測量離子荷質比(電荷-質量比)的分析方法，其基本原理是使待檢測物品中各組分在離子源中發生電離，生成不同荷質比的帶電荷的離子，經加速電場的作用，形成離子束，進入質量分析器。在質量分析器中，再利用電場和磁場使發生相反的速度色散，將它們分別聚焦而得到質譜圖，從而確定其質量。

目前，已有的多種針對抗HIV藥物的分析檢測方法，包括液相色譜-紫外光(HPLC-UV)檢測以及液相色譜-質譜(HPLC/MS/MS)聯用檢測，均存在樣品處理方法繁瑣以及檢測靈敏度不高、不能同時檢測多個國內臨床常用的抗反轉錄病毒藥物的缺陷。

目前已有的針對EFV濃度檢測的臨床研究中，多數研究只檢測某一時段的患者血漿藥物濃度以評估長期的治療效果，而忽略了藥物濃度會隨著時間的推移而發生變化；還有研究則在臨床研究招募受試者時未將初始接受抗病毒治療患者和抗病毒治療失敗患者區分，此種研究基線存在異質性，并且可能會干擾研究結果的分析。

發明內容

本發明的目的是克服已知技術的缺陷，提供一種簡便、快速、靈敏的可同時測定多種抗HIV藥物血漿濃度方法

本發明采用蛋白沉淀聯合液液萃取的方法處理臨床標本，然后建立液相色譜-質譜聯用(LC-MS/MS法)可同時測定多種臨床常用的抗HIV藥物血漿濃度方法。

本方法無需昂貴的設備和試劑，具有操作簡便，快速，靈敏度高，血漿用量少，成本低等優點，并且能同時定量測定人血漿中齊多夫定(AZT)、拉米夫定(3TC)、司他夫定(d4T)、奈韋拉平(NVP)、依非韋倫(EFV)、洛匹那韋(LPV)和利托那韋(RTV)7種抗反轉錄病毒藥物的濃度，適合常規治療藥物濃度監測。

具體的，本發明采用LC-MS/MS法同時測定7種常用抗反轉錄病毒藥物血漿濃度的方法。包括下述步驟：

1、血漿樣品經堿化沉淀蛋白后，用乙酸乙酯液-液萃取；