[發明專利]重組人FSHR-57多肽蛋白及其制備方法和應用

無效

• 申請號: 201010179522.4
• 申請日: 2010-05-21
• 公開（公告）號: CN101863973A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發明（設計）人: 王心如;顧愛華;龍燕;李迎春;王守林;夏彥愷;楊驊
• 申請（專利權）人: 南京醫科大學
• 主分類號: C07K14/72
• 分類號: C07K14/72;C12N15/12;C12N15/63;A61K39/00;A61P15/16
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 李紀昌

一、技術領域

本發明屬生物工程領域，具體涉及一種用于男性避孕的重組人FSHR-57多肽蛋白及其制備方法和藥學應用。

二、背景技術

隨著世界人口的迅速增長，人口控制的任務更為艱巨，但以往大部分責任由女性承擔，社會的發展更需要男性發揮積極的作用。

研發中的男用避孕藥分為激素類避孕藥和非激素類避孕藥(外用殺精子劑、中草藥以及避孕疫苗)。但男性激素避孕藥無論是單獨使用還是聯合使用，都還有許多不盡人意之處有待完善。各類非激素類避孕藥也存在不足：殺精子劑易出現過敏反應，且單獨使用效果不理想；中草藥類毒副作用大，成分復雜且機理尚不明確，目前僅用于動物實驗。男性避孕方法面臨“可靠方法不可逆，可逆方法不可靠”的尷尬局面，至今尚無一種真正可用于臨床的安全、長效、可逆的方法問世。在避孕機制和安全性評價等方面也缺乏深入系統的研究。

至20世紀中葉，隨著免疫學與分子生物學的迅速發展以及控制世界人口的需要，避孕疫苗研究開始了引人注目的進展。經過數十年的動物實驗以及少量的臨床觀察，證明這種方法具有經濟、簡便、失敗率低、安全可靠、相對長效、可逆、無需使用工具及外源激素等優點，已成為當今發展中國家乃至發達國家計劃生育研究課題中極具吸引力的選擇目標之一。避孕疫苗的基本原理就是應用機體自身的免疫防御機制來產生一個對抗計劃外妊娠的反應，具體地說，就是使用生殖過程中有關的抗原成分制成避孕疫苗，誘導受者產生相應的體液或細胞免疫應答，從而阻抑受孕。

卵泡刺激素受體(follicle-stimulating?hormone?receptor，FSHR)由669個氨基酸組成，存在于人和哺乳動物的睪丸支持細胞和卵泡顆粒細胞，可通過介導FSH的信號影響雄性青春期生精啟動、成年期生精過程和雌性卵細胞各階段的發育。FSHR基因敲除的雄性小鼠可引起生精障礙及生育力下降。因其在生殖中的重要作用，FSHR已成為男性避孕疫苗的候選靶標。本專利申請者在獼猴研究中發現FSHR的特定序列(N端57氨基酸)多肽蛋白可有效的產生較高滴度的抗體，且未發現其對激素水平有副作用，可望成為一種安全、有效、可逆的男性避孕疫苗。

三、發明內容

發明目的：本發明的目的是提供一種重組人FSHR-57多肽蛋白及其制備方法和該多肽在男性避孕疫苗上應用。

本發明提出的FSHR-57多肽疫苗，利用原核表達系統表達重組人FSHR?1-57位氨基酸的多肽疫苗，運用切膠回收技術純化該蛋白，結合透析復性恢復蛋白的活性和結構。

技術方案：重組人FSHR-57多肽蛋白，它的氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所述。

重組人FSHR-57多肽蛋白的cDNA，它的核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所述。

上述cDNA的表達載體。

上述cDNA的表達載體為pET-28a(+)-FSHR57。

制備重組人FSHR-57多肽蛋白的方法，包括用pET-28a(+)-FSHR57轉化寄主細胞，培養轉化體，獲得重組人FSHR-57。寄主細胞是大腸桿菌。

上述所得到的重組人FSHR-57多肽蛋白在制備男性避孕疫苗中的應用。

有益效果：本發明是一種男性抗生育的多肽疫苗及其制備方法，該多肽疫苗選取了卵泡刺激素受體(FSHR)N端57位氨基酸，含B細胞表位且有效避免與黃體生成素受體(LHR)、甲狀腺刺激素(TSHR)的交叉反應。運用原核表達、結合切膠純化及梯度透析復性的方法，制備出高純度的FSHR-57蛋白多肽，經Non-reduced?PAGE+Western?blot，HPLC及質譜氨基酸測序鑒定，確認該方法制備的蛋白多肽準確無誤且純度高于97％。FSHR-57蛋白多肽安全性好，不干擾睪酮及雌二醇等性激素的水平，具較強的免疫原性，可以成為男性避孕疫苗的候選。

四、附圖說明

圖1，FSHR表位預測圖(箭頭所指部分為位于膜外氨基端抗原指數最高的一段序列)，提示N端57氨基酸區域含B細胞表位，適合制備多肽疫苗。

圖2，重組質粒pET-28a(+)-FSHR?PCR驗證圖；

圖3，重組質粒pET-28a(+)-FSHR測序結果圖；

圖4，FSHR-57蛋白切膠純化電泳分析圖；

圖5，FSHR-57蛋白的非還原SDS-PAGE結合免疫印記(WB)結果；

圖6，FSHR-57蛋白的HPLC結果：

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