[發(fā)明專利]硫酸化半乳聚糖及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010177293.2
• 申請日: 2010-05-17
• 公開（公告）號: CN101851298A
• 公開（公告）日: 2010-10-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 潘俊芳;王順春;方通;施松善;單圓圓;朱勤
• 申請（專利權(quán)）人: 上海和臣醫(yī)藥工程有限公司;上海中醫(yī)藥大學(xué)
• 主分類號: C08B37/00
• 分類號: C08B37/00;A61K31/737;A61P7/02
• 代理公司: 上海開祺知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31114
• 代理人: 費開逵

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于天然藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有確切分子量分布范圍(分子量為100-200kDa)的硫酸化半乳聚糖及其制備方法。

背景技術(shù)

正如中國專利申請200610026830.7公開的技術(shù)內(nèi)容，從蜈蚣藻(Grateloupia?filicina)中分離提取的硫酸化半乳聚糖具有抗凝血、抗血栓、抗病毒和抗腫瘤活性。由于多糖是高分子化合物，其分子量高低不僅與其活性相關(guān)，還與其吸收密切相關(guān)。口服用藥相對于注射用藥，具有優(yōu)越的安全性和方便性。因此要將蜈蚣藻來源的硫酸化半乳聚糖應(yīng)用到臨床，制造出一種口服有效的藥物，還需要對其分子量與口服吸收的藥效之間的關(guān)系加以研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種硫酸化半乳聚糖及其制備方法，即對從蜈蚣藻來源的硫酸化多糖進(jìn)行新的制備方法的研究，篩選不同分子量分布與抗凝血活性之間的關(guān)系，從而獲得一種新的口服有效的硫酸化多糖。

本發(fā)明所提供的硫酸化半乳聚糖，分子量為100-200kDa，硫酸基團(tuán)含量為26wt％～32wt％，其重復(fù)單元結(jié)構(gòu)為：

R＝H，CH₃，Xyl(木糖)或Glc(葡萄糖)

[-(1→3)-β-D-Galactose-2-SO₄-(1→4)-β-D-Galactose-]_n

所述硫酸化半乳聚糖中半乳聚糖的含量為60wt％～69wt％。

所述硫酸化半乳聚糖不含蛋白質(zhì)。

所述硫酸化半乳聚糖采用以下方法制備而成，具體包括以下步驟：

1)水提取：取蜈蚣藻藥材，除去鹽及泥沙，揀去雜質(zhì)，放入提取罐中，加藥材質(zhì)量15-20倍水，加熱至90-100℃提取1-2小時(從溫度達(dá)到90℃計時)，過300目濾布或3000-4000rpm轉(zhuǎn)速的離心分離除去藥渣，收集提取液。

2)酸降解：將上述提取液升溫至60-70℃并保持，用1mol/L鹽酸或硫酸調(diào)pH值至2～3，保溫2h，取樣檢測溶液中多糖的分子量，至分子量為180-200kDa，停止加熱，用1mol/L氫氧化鈉溶液中和至pH6～7，離心(3000-4000rpm)，棄去殘渣，收集上清液。

3)膜過濾：離心上述上清液，然后過0.22-0.45μm孔徑的醋酸纖維素或偏氟濾膜，收集濾液；濾液用截留分子量為100kDa的聚偏氟乙烯或聚砜材質(zhì)的超濾膜，待濾液體積減至初始體積8～10％時，邊超濾邊加入初始體積8～10％的純凈水(加入純凈水速度與濾過液留出速度一致)，繼續(xù)超濾至截留濾液體積為初始體積的8～10％。

4)醇沉：將上述超濾截留濾液轉(zhuǎn)至醇沉灌中，攪拌下加入3倍重量的95％乙醇，靜置12小時，離心(3000-4000rpm)收集沉淀。

5)干燥：將上述沉淀置真空干燥箱，保持80-90℃真空干燥24小時，至含水量小于5％，即得硫酸化半乳聚糖。

其中，本發(fā)明所述的分子量，是指采用凝膠色譜法，以標(biāo)準(zhǔn)多糖(葡聚糖)為對照品，通過GPC軟件計算獲得。具體方法如下：1～2mg標(biāo)準(zhǔn)多糖(葡聚糖)和硫酸化半乳聚糖樣品，用流動相配成2mg/ml溶液，10000rpm離心10min，吸取上清液轉(zhuǎn)入液相樣品瓶，備用。Aglient?1100高效液相色譜儀，配備示差檢測器，KS-804、KS-805串聯(lián)柱(Shodex公司)，流動相為0.2mol/L氯化鈉溶液，柱溫40℃，流速0.8ml/min，進(jìn)樣體積25μl，將標(biāo)準(zhǔn)多糖和硫酸化半乳聚糖樣品溶液依次進(jìn)樣，測定保留時間，用GPC軟件計算硫酸化半乳聚糖的分子量。本發(fā)明所述的硫酸化半乳聚糖的分子量分布范圍為100-200kDa。

通過下述方法檢測表明本發(fā)明的硫酸化半乳聚糖不含蛋白質(zhì)：多糖樣品用水溶解配成0.1mg/ml溶液，以蒸餾水為空白，掃描200～400nm下的紫外吸收圖譜。結(jié)果多糖樣品僅在256nm有一吸收峰，各多糖樣品在280nm以上波長均無明顯吸收峰，可判斷其中不含蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)通常在280nm以上波長有明顯吸收峰。

采用硫酸-苯酚法測定得本發(fā)明的硫酸化半乳聚糖中半乳聚糖的含量為60wt％～69wt％。具體如下：

1)對照品溶液制備：精密稱取105℃干燥至恒重的半乳糖標(biāo)準(zhǔn)品4mg，用蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)入100ml容量瓶，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，即得(每1ml含半乳糖40μg)。