[發(fā)明專利]利用雙S形LEVENBERG-MARQUARDT和穩(wěn)健線性回歸的溫度階躍校正

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010176765.2
• 申請(qǐng)日: 2006-12-19
• 公開（公告）號(hào): CN101872386A
• 公開（公告）日: 2010-10-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: R·T·庫(kù)爾尼克
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 霍夫曼-拉羅奇有限公司
• 主分類號(hào): G06F19/00
• 分類號(hào): G06F19/00;C12M1/00
• 代理公司: 中國(guó)專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 胡莉莉;王忠忠

本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2006年12月19日、申請(qǐng)?zhí)枮?00610169383.0以及發(fā)明名稱為“利用雙S形LEVENBERG-MARQUARDT和穩(wěn)健線性回歸的溫度階躍校正”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明廣泛地涉及用于處理表示S形曲線或生長(zhǎng)曲線的數(shù)據(jù)的系統(tǒng)和方法，并且更具體地涉及用于校正溫度變化和用于確定PCR擴(kuò)增曲線中的特征周期閾值(Ct)或肘值(elbow?value)的系統(tǒng)和方法。

背景技術(shù)

聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是一種用于酶合成或擴(kuò)增限定的核酸序列的離體方法。該反應(yīng)典型地利用兩種寡核苷酸引物，這兩種寡核苷酸引物雜交成相對(duì)股并且位于模板或要被擴(kuò)增的目標(biāo)DNA序列的側(cè)面。通過熱穩(wěn)定DNA聚合酶來催化這些引物的延伸。包括由聚合酶引起的模板變性、引物退火和退火引物的延伸的一系列重復(fù)周期導(dǎo)致特定DNA片斷的指數(shù)累積。熒光探針或標(biāo)記典型地被用于促進(jìn)擴(kuò)增過程的檢測(cè)和量化的方法中。

在圖1中示出了典型的實(shí)時(shí)PCR曲線，其中針對(duì)典型的PCR過程畫出了熒光強(qiáng)度值對(duì)周期數(shù)。在這種情況下，在PCR過程的每一周期中監(jiān)控PCR產(chǎn)物的形成。通常在溫度循環(huán)器中測(cè)量擴(kuò)增，該溫度循環(huán)器包括用于在擴(kuò)增反應(yīng)過程中測(cè)量熒光信號(hào)的部件和裝置。這種溫度循環(huán)器的例子是Roche?Diagnostics?LightCycler(Cat.No.20110468)。借助熒光標(biāo)記的雜交探針來例如檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，該熒光標(biāo)記的雜交探針僅僅在它們被結(jié)合到目標(biāo)核酸上時(shí)才發(fā)射熒光信號(hào)，或者在某些情況下也借助結(jié)合到雙股DNA上的熒光染料來例如檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

對(duì)于典型的PCR曲線來說，識(shí)別在基線區(qū)域末端處的通常被稱為肘值或周期閾值(Ct)的過渡點(diǎn)極其有助于理解PCR擴(kuò)增方法的特征。該Ct值可被用作PCR過程的效率的量度。例如，針對(duì)要被分析的所有反應(yīng)確定所規(guī)定的信號(hào)閾值，并且針對(duì)目標(biāo)核酸以及針對(duì)例如標(biāo)準(zhǔn)或看家(housekeeping)基因的參考核酸確定用于達(dá)到該閾值所需的周期數(shù)(Ct)?；卺槍?duì)目標(biāo)核酸和參考核酸所獲得的Ct值，可以確定目標(biāo)分子的絕對(duì)或相對(duì)拷貝數(shù)(Gibson等人的Genome?Research6：995-1001；Bieche等人的Cancer?Research?59：2759-2765，1999年；WO?97/46707；WO?97/46712；WO?97/46714)。圖1中在基線區(qū)域15的末端處的區(qū)域20中的肘值將在周期數(shù)30的區(qū)域中。

在一些PCR試驗(yàn)、例如HIV試驗(yàn)中，在PC反應(yīng)過程中典型地存在退火溫度變化。該溫度變化引起在出現(xiàn)溫度變化的周期數(shù)時(shí)的熒光信號(hào)的隨后變化。因此，為了計(jì)算正確的Ct值，有必要校正該信號(hào)變化。出現(xiàn)溫度變化的周期是已知的，并且如果基線是完全平坦的并且不具有峰值，則校正該溫度變化將是簡(jiǎn)單的事情。不幸地，基線常常是傾斜的并且也可能在任何位置處包含信號(hào)峰值(異常數(shù)據(jù))。如果在溫度變化位置處出現(xiàn)峰值，則更難以校正基線曲線。

因此，期望提供用于確定曲線、例如S形曲線或生長(zhǎng)曲線、以及尤其是PCR曲線中的肘值的系統(tǒng)和方法，該系統(tǒng)和方法克服上述的和其它的缺點(diǎn)。具體地，該系統(tǒng)和方法應(yīng)以對(duì)于例如異常數(shù)據(jù)的人為因素(artifact)來說可靠且穩(wěn)健的方式實(shí)施溫度階躍校正。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供用于通過針對(duì)在PCR過程期間可能出現(xiàn)的溫度變化對(duì)PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行校正來改進(jìn)PCR擴(kuò)增曲線中的Ct確定的系統(tǒng)和方法。

根據(jù)一個(gè)方面，具有通過Levenberg-Marquardt(LM)回歸方法所確定的參數(shù)的雙S形函數(shù)被用于找到在溫度變化之后的區(qū)域中曲線的一部分的近似，其中出現(xiàn)溫度變化的周期被稱為“CAC”。為在溫度變化之前的區(qū)域中曲線的一部分確定穩(wěn)健線性近似。利用線性近似和LM方法來確定周期CAC或CAC+1的熒光強(qiáng)度的值，并且從表示在出現(xiàn)溫度變化之前曲線的一部分的數(shù)據(jù)集的一部分中減去這些值的差值，以產(chǎn)生已校正變化的數(shù)據(jù)集。然后，該已校正變化的數(shù)據(jù)集被返回，并且可以被顯示或另外被用于進(jìn)一步的處理。

在本發(fā)明的第一方面中，提供一種計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)的、校正具有基線部分和生長(zhǎng)部分的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)生長(zhǎng)曲線的數(shù)據(jù)集中的溫度階躍變化的方法，該方法包括：

-接收聚合酶鏈反應(yīng)生長(zhǎng)曲線的數(shù)據(jù)集，其中所述數(shù)據(jù)集包括動(dòng)態(tài)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)過程的多個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，每一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)具有一對(duì)坐標(biāo)值(x，y)，其中x表示周期數(shù)，并且y表示擴(kuò)增多核苷酸的累積；