[發(fā)明專利]一種利用三聚氰胺衍生物制備三聚氰胺高效價抗體方法的建立

無效

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• 申請日: 2010-05-11
• 公開（公告）號: CN101851292A
• 公開（公告）日: 2010-10-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 華權(quán)高;沈鶴霄
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢華美生物工程有限公司
• 主分類號: C07K16/44
• 分類號: C07K16/44
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種小分子的抗原、抗體制備方法的建立。

背景技術(shù)

小分子化合物，在組織化學(xué)上被稱為半抗原，僅具有與相應(yīng)抗體或致敏淋巴細胞的免疫反應(yīng)性，而無免疫原性。對于半抗原的檢測一般采用氣相色譜、高壓液相色譜、質(zhì)譜等手段，但是免疫學(xué)檢測方法在半抗原的檢測上逐漸顯示出其不可替代的優(yōu)勢。免疫學(xué)檢測法不像傳統(tǒng)的色譜和質(zhì)譜等方法那樣需要復(fù)雜、昂貴的設(shè)備，此外還具有易操作，前處理過程簡單，成本低，檢測快速、準(zhǔn)確、靈敏，可實現(xiàn)高通量、自動化檢測等優(yōu)點，因此具有極為廣泛的應(yīng)用前景。

本發(fā)明中的三聚氰胺(Melamine)(化學(xué)式：C₃H₆N₆)，俗稱密胺、蛋白精，IUPAC命名為[1，3，5-三嗪-2，4，6-三氨基]，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機化合物，被用作化工原料。它是白色單斜晶體，幾乎無味，微溶于水(3.1g/L常溫)，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、熱乙二醇、甘油、吡啶等，對身體有害，不可用于食品加工或食品添加物。

食品工業(yè)中常常需要測定食品的蛋白質(zhì)含量，由于直接測量蛋白質(zhì)技術(shù)上比較復(fù)雜，所以常用一種叫做凱氏定氮法的方法，通過測定氮原子的含量來間接推算食品中蛋白質(zhì)的含量。由于三聚氰胺(含氮量66％)與蛋白質(zhì)(平均含氮量16％)相比含有更高比例的氮原子，所以被一些造假者利用，添加在食品中以造成食品蛋白質(zhì)含量較高的假象，從而造成諸如2007年美國寵物食品污染事件和2008年中國毒奶粉事件等嚴重的食物安全事故。

中國國家食品質(zhì)量監(jiān)督檢測中心在2008年9月13日指出，三聚氰胺屬于化工原料，是不允許添加到食品中的，故暫未設(shè)定像農(nóng)藥般的殘留標(biāo)準(zhǔn)限制。10月8日，衛(wèi)生部、工業(yè)和信息化部、農(nóng)業(yè)部、國家工商行政管理總局和國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局聯(lián)合發(fā)布公告，制定三聚氰胺在乳與乳制品中的臨時管理值：嬰幼兒配方乳粉中三聚氰胺的限量值為1mg/kg，高于限量值的產(chǎn)品一律不得銷售。液態(tài)奶(包括原料乳)、奶粉、其它配方乳粉中三聚氰胺的限量值為2.5mg/kg，高于限量值的產(chǎn)品一律不得銷售。含乳15％以上的其它食品中三聚氰胺的限量值為2.5mg/kg，高于限量值的產(chǎn)品一律不得銷售。中國衛(wèi)生部2010年4月22日公布66項新乳品安全國家標(biāo)準(zhǔn)，包括乳品產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)15項、生產(chǎn)規(guī)范2項、檢驗方法標(biāo)準(zhǔn)49項。其中，新的乳品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中不再設(shè)置三聚氰胺相關(guān)規(guī)定。“不再設(shè)置三聚氰胺相關(guān)規(guī)定”，也就是說，三聚氰胺不再具備“合法”身份被“限量添加”到乳品制品中去。

三聚氰胺屬于小分子化合物，與其他很多小分子化合物一樣，一般采用GC、MS、LC-UV法、高效液相色譜法等測定三聚氰胺含量，相關(guān)檢測機構(gòu)建立的方法也少有報道。農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)NY/T?1372-2007中建立的飼料中三聚氰胺的測定方法是HPLC法和GC-MS法。最近國家質(zhì)檢總局與國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會聯(lián)合發(fā)布的《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》(GB/T?22388-2008)中也是采用HPLC法、LC-MS/MS法、GC-MS和GC-MS/MS法。但以上方法存在過程冗長、需要衍生、試劑用量較大及靈敏度低等缺點而難以推廣。

目前三聚氰胺免疫學(xué)檢測方法也有報道，市面上也已經(jīng)出現(xiàn)許多三聚氰胺的酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒。但是這些ELISA試劑盒的靈敏度普遍偏低，已經(jīng)遠遠不能滿足新出臺的“新的乳品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中不再設(shè)置三聚氰胺相關(guān)規(guī)定”的國家法規(guī)。因此高靈敏度的ELISA試劑盒的開發(fā)成為當(dāng)務(wù)之急。

在高靈敏度ELISA試劑盒的開發(fā)中，獲得高效價、高親和力抗體是最重要的先決條件之一。根據(jù)我們對三聚氰胺的理化性質(zhì)分析及實際的實驗過程分析總結(jié)三聚氰胺的疏水性對于載體蛋白的偶聯(lián)造成了非常大的困難，因為三聚氰胺為脂溶性，而載體蛋白為水溶性，只能通過“間相相轉(zhuǎn)移催化”進行偶聯(lián)，另外三聚氰胺具備三個相同的氨基，直接的偶聯(lián)將會影響三聚氰胺的空間結(jié)構(gòu)，目前常規(guī)的方法是采取先封閉部分氨基后再進行偶聯(lián)，該方法的缺點也同樣存在操作難度大，不好控制的缺點使得最終獲得的抗體效價不高。

基于上述存在的問題，我們通過化學(xué)方法合成不改變?nèi)矍璋访庖咴缘梢詢?yōu)化三聚氰胺溶解度等理化性質(zhì)的化合物通過較為常用簡單的EDC法偶聯(lián)載體蛋白作為免疫原進而免疫動物獲得針對于三聚氰胺的高效價抗體。并可通過該抗體進行三聚氰胺ELISA試劑盒、三聚氰胺免疫組化試劑盒、三聚氰胺化學(xué)發(fā)光法等的開發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種利用三聚氰胺衍生物制備三聚氰胺高效價抗體方法的建立。