[發明專利]一種檢測甲型H1N1流感病毒的試劑盒

無效

• 申請號: 201010174472.0
• 申請日: 2010-05-18
• 公開（公告）號: CN101824492A
• 公開（公告）日: 2010-09-08
• 發明（設計）人: 孫國明
• 申請（專利權）人: 天津朝海科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/78
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

一、技術領域

本發明涉及一種用納米金顆粒檢測甲型H1N1流感病毒DNA或RNA經環介導等溫核酸擴增技術擴增后產物DNA的試劑盒，屬于生物檢測技術領域。

二、背景技術

對基因(DNA)及其轉錄產物(RNA)的高靈敏性、高特異性、簡單、快速的檢測，對于疾病的早期診斷和治療以及在在衛生防疫、環境監測、檢驗檢疫等領域都具有十分重要的意義。以往在這方面較為準確靈敏的檢測方法有熒光標記法、放射性標記等方法，這些方法都需要復雜的操作和特殊的設備，應用范圍很窄。1993年PE公司的Dr.Kary?B.Mullis發明了聚合酶鏈式反應(Polymerase?Chain?Reaction)，簡稱PCR。隨后PCR技術大規模的應用于生物科研和臨床治療中，對DNA的檢測進入了新的時代，Dr.Mullis為此還獲得了1993年的諾貝爾化學獎。雖然PCR方法具有快速、靈敏、準確性高、操作較簡單等優點，但由于其反應進行和產品DNA的檢測需要特殊的儀器，PCR技術的使用一直被限定在專業的實驗室和醫院里。

2001年日本榮研化學株式會社研制出了一種新型DNA擴增方式，環介導等溫核酸擴增技術(LAMP)可以在恒溫條件下實現DNA的高效快速擴增，該方法反應條件簡單，DNA擴增效率高，因此在核酸檢測方面具有明顯優勢。但是對LAMP擴增制備的DNA產物使用常規的檢測方法，如電泳法，熒光染料法等，均無法排除LAMP擴增所帶來的假陽性問題，而且需要特殊的儀器，因此限制了LAMP技術的實際應用。

甲型H1N1流感為急性呼吸道傳染病，其病原體是一種新型的甲型H1N1流感病毒，在人群中傳播。與以往或目前的季節性流感病毒不同，該病毒毒株包含有豬流感、禽流感和人流感三種流感病毒的基因片段。人群對甲型H1N1流感病毒普遍易感，并可以人傳染人，人感染甲流后的早期癥狀與普通流感相似，包括發熱、咳嗽、喉痛、身體疼痛、頭痛、發冷和疲勞等，有些還會出現腹瀉或嘔吐、肌肉痛或疲倦、眼睛發紅等。目前針對甲型H1N1流感病毒缺乏簡單、快速、便于使用和成本低廉的檢測方法。

三、發明內容

本發明的目的是提出一種用納米金顆粒檢測甲型H1N1流感病毒經環介導等溫核酸擴增技術擴增后產物DNA的試劑盒，從而判定甲型H1N1流感病毒的存在與否。本發明試劑盒結合環介導等溫核酸擴增技術和生物納米技術，提高生物分子檢測的靈敏度，是一種操作簡單、快速、準確、成本低廉、不需要專業儀器設備的方法，可以廣泛應用于家庭診斷、臨床診斷、傳染病控制、環境監測、檢驗檢疫，生物技術等領域的高靈敏度的流感病毒檢測。

本發明試劑盒包括兩部分：

1.標記有可以識別甲型H1N1流感病毒特定序列的分子探針的納米金顆粒；

2.可以擴增待檢測樣品中的甲型H1N1流感病毒DNA或先經過逆轉錄過程后再擴增待檢測樣品中的甲型H1N1流感病毒RNA的環介導等溫核酸擴增體系。

該試劑盒的工作原理為：

1.納米金顆粒標記有能識別甲型H1N1流感病毒特定序列的分子探針，分子探針被固定在納米金顆粒的表面。

2.待檢測樣品中的甲型H1N1流感病毒DNA分子或甲型H1N1流感病毒RNA經環介導等溫核酸擴增技術大量復制或先經逆轉錄過程后大量復制，甲型H1N1流感病毒的目標片段被放大10⁹倍，產生的擴增產物DNA具有多重重復序列。

3.混合納米金顆粒和環介導等溫核酸擴增體系，甲型H1N1流感病毒經環介導等溫核酸擴增技術以后的產物DNA與納米金顆粒上能識別甲型H1N1流感病毒特定序列的分子探針雜交。

4.納米金顆粒沿環介導等溫核酸擴增技術產物DNA分子鏈形成聚集體(如附圖所示)，進而引發納米金顆粒聚集處(例如溶液中、固體表面等)的顏色變化，依據顏色變化可以判斷待測樣品是否具有甲型H1N1流感病毒DNA或RNA。

四、附圖說明

標記有分子探針的納米金顆粒與甲型H1N1流感病毒經環介導等溫核酸擴增技術以后的產物DNA雜交示意圖，納米金顆粒沿環介導等溫核酸擴增技術產物DNA分子鏈形成聚集體。

五、具體實施方式

本發明試劑盒包括2管溶液，一管中是標記有可以識別甲型H1N1流感病毒特定序列的分子探針的納米金顆粒溶液50μl，一管中是250μl可以擴增待檢測樣品中的甲型H1N1流感病毒DNA或先經過逆轉錄過程后再擴增待檢測樣品中的甲型H1N1流感病毒RNA的環介導等溫核酸擴增體系。

納米金顆粒溶液中含有直徑為20nm的納米金顆粒，濃度為1.2nM，納米金顆粒表面標記有巰基修飾的DNA探針。