[發(fā)明專利]一種酰胺水解酶的高效表達及應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010173735.6
• 申請日: 2010-05-17
• 公開（公告）號: CN102250934A
• 公開（公告）日: 2011-11-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 呂中原;楊仲毅;徐期;李叢撐;王獻周;甘春暉;彭春龍;張小英;白驊
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江海正藥業(yè)股份有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/55;C12N15/66;C12N1/21;C12N9/78;C12P41/00;C12P7/42;C12R1/19
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1.一種包括酰胺水解酶基因(DAM基因)的核苷酸序列的表達載體，其中DAM基因的核苷酸序列為序列表中SEQ?ID?No.1所示的堿基序列。

2.權(quán)利要求1所述的表達載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

1)獲取含有DAM基因的Delftia?tsuruhatensis(CCTCCNo.M205114)的基因組DNA；

2)根據(jù)R-型異構(gòu)體立體選擇性酰胺水解酶基因的核苷酸序列設(shè)計引物A和引物B；

3)以Delftia?tsuruhatensis基因組DNA為摸板，加入引物A、引物B、Taq?DNA聚合酶以及dNTP混合物進行PCR擴增；

4)PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳后，采用DNA膠回收試劑盒回收1.4kb大小的PCR擴增片斷(DAM基因)；

5)將PCR擴增到的DAM基因與克隆載體pUC118連接，形成克隆載體pUC118-DAM；

6)pUC118-DAM和表達載體分別用限制性內(nèi)切酶消化，形成互補的粘性末端，經(jīng)T4?DNA連接酶連接，形成含DAM基因的表達載體。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達載體的構(gòu)建方法，其中第6步所述的表達載體選自質(zhì)粒、粘粒或噬菌體。

4.權(quán)利要求3所述的表達載體的構(gòu)建方法，其中質(zhì)粒選自pUC，pBluescript(Stratagene)，pET(Novagen?Inc.，Madison，Wis.)，pQE(Qiagen)，pSE420或pLEX(Invitrogen)，但不僅限于這些質(zhì)粒。

5.根據(jù)權(quán)利要求3-4任一項所述的表達載體的構(gòu)建方法，其中所述質(zhì)粒為pET。

6.根據(jù)權(quán)利要求3-5任一項所述的表達載體的構(gòu)建方法，其中所述質(zhì)粒為pET24a(+)。

7.根據(jù)權(quán)利要求4-6任一項所述的表達載體的構(gòu)建方法，其中表達載體上的操縱子可選自乳糖操縱子、半乳糖操縱子、或色氨酸操縱子，其中優(yōu)選LacI操縱子。

8.根據(jù)權(quán)利要求4-6任一項所述的表達載體的構(gòu)建方法，其中載體上的啟動子可用λpL啟動子、Tet啟動子、和T7啟動子，其中優(yōu)選T7啟動子。

9.一種用于表達DAM基因工程菌株，其特征是是將權(quán)利要求1所述的表達載體轉(zhuǎn)化到宿主微生物中得到基因工程菌株。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的基因工程菌株，其特征是宿主微生物為大腸桿菌。

11.根據(jù)權(quán)利要求9-10任一項所述的基因工程菌株，其特征是該基因工程菌株為大腸埃希氏菌(Escherichia?coli)BL21(DE3)/pET24a(+)-DAM。

12.一種制備具有R-型異構(gòu)體立體選擇性的重組酰胺水解酶的方法，其特征在于用權(quán)利要求9-11任一項所述的基因工程菌在誘導劑條件下發(fā)酵來生產(chǎn)重組R-型選擇性酰胺水解酶。

13.根據(jù)權(quán)利權(quán)利要求12的酰胺水解酶的制備方法，其中誘導劑選自IPTG或α-乳糖；發(fā)酵、誘導溫度范圍控制在20-42℃之間；培養(yǎng)模式可選自批發(fā)酵培養(yǎng)或流加培養(yǎng)；培養(yǎng)基選自蛋白胨、酵母粉、氯化鈉或其它基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基。

14.根據(jù)權(quán)利要求12-13任一項的方法制備得到的重組酰胺水解酶。

15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的重組酰胺水解酶，所述重組酰胺水解酶選自a)由SEQ?ID?No.2所述的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或b)具有與SEQ?ID?No.2所述的氨基酸序列至少有80％同源性的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或c)在SEQ?ID?No.2所述的氨基酸序列前端或后端加上一段SEQ?ID?No.3所述的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。

16.根據(jù)權(quán)利要求12-13任一項的方法所得到的酰胺水解酶用于水解酰胺類化合物的用途。

17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的用途，所述酰胺類化合物選自(R，S)-型酰胺類化合物或手性酰胺類化合物。

18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的用途，其中(R，S)-型酰胺類化合物選自R/S-2，2-二甲基環(huán)丙甲酰胺。