[發(fā)明專利]一種生產(chǎn)阿維菌素的基因工程方法及其專用菌株

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010173186.2
• 申請日: 2010-05-14
• 公開（公告）號: CN102241750A
• 公開（公告）日: 2011-11-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張立新;卓英;劉梅;高弘;周賢龍
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C07K14/36
• 分類號: C07K14/36;C12N15/31;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/21;C12P19/62;C12R1/465
• 代理公司: 北京紀凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;任鳳華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)阿維菌素的基因工程方法及其專用菌株。

背景技術(shù)

阿維菌素(avermectin，AVM)是一種由阿維鏈霉菌(Streptomyces?avermitilis)發(fā)酵產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，它有八個組分(A1a，A1b，A2a，A2b，B1a，B1b，B2a，B2b)，其中B1a組分的殺蟲活性最強，對線蟲、螨蟲和節(jié)肢動物具有良好的殺滅作用，殺蟲活性比一般化學農(nóng)藥高出幾十倍。阿維菌素的作用機理與常規(guī)化學殺蟲劑不同，它的作用靶點是線蟲及節(jié)肢動物類寄生蟲的神經(jīng)傳導介質(zhì)γ-氨基丁酸(GABA)，對哺乳動物的毒性很小，選擇性極高。該抗生素在植物中殘留時間很短，并且在土壤中很快被微生物分解為無毒物質(zhì)。由于阿維菌素的這些突出的優(yōu)點，其被公認為是一種最為安全有效的微生物來源的殺蟲劑，因此它在農(nóng)業(yè)、林業(yè)、醫(yī)藥和獸用上具有非常廣闊的市場前景和應(yīng)用價值。同時以阿維菌素為母體，還可以開發(fā)出一系列活性更高、選擇性更強、使用更加安全的衍生新品種，已商品化的品種包括伊維菌素、埃瑪菌素、多拉菌素、埃珀利諾菌素和塞拉菌素等。此外，近年來又有研究者發(fā)現(xiàn)阿維菌素有抗腫瘤的功效，并且對腫瘤細胞的抗藥性也有一定的抑制作用。

目前，阿維菌素已在國內(nèi)實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化，取得了巨大的經(jīng)濟和社會效益。但我國阿維菌素的生產(chǎn)菌株還存在著發(fā)酵單位低，生產(chǎn)成本高等問題，如何提高阿維菌素的產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本，將為我國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展起到促進作用。此外，不僅是阿維菌素，如何篩選和優(yōu)化菌株、使產(chǎn)率和原料利用率實現(xiàn)最大化是我國微生物發(fā)酵工程面臨的普遍問題。目前用于提高鏈霉菌的抗生素產(chǎn)量的方法主要包括兩大類，一類是傳統(tǒng)的誘變育種方法，通過物理化學方法對菌株進行誘變，然后在誘變后代中篩選高產(chǎn)菌株；另一類是通過遺傳學的方法，對菌株進行直接的遺傳改變，提高抗生素的產(chǎn)量。通過物理化學方法對菌株進行誘變雖然已經(jīng)取得了一定的成績，得到了大量的高產(chǎn)菌株，但它們的不足之處也很明顯，主要包括耗費大量人力、物力和時間，篩選工作比較復雜，存在一定盲目性，在引入有利變異的同時可能也會產(chǎn)生很多有害的變異，而有害的菌種變異往往會影響發(fā)酵過程的優(yōu)化和放大；這些傳統(tǒng)的菌種選育方式由于對引起功能變化的生物學基礎(chǔ)不了解，因此較難推廣應(yīng)用于其他菌種。隨著細菌基因組研究的不斷深入，對細菌基因功能的認識不斷深刻，人們越來越傾向于用遺傳學手段對菌株進行改造。用遺傳學的方法可以將功能已知的基因進行改造，增強了操作的針對性，而且使工作量大大降低，篩選時間也得到縮短。因此，通過基因工程手段改造阿維鏈霉菌以提高阿維菌素的產(chǎn)量，具有重要的意義。

2001年Kitasato研究所完成了阿維鏈霉菌的基因組測序，對其中負責阿維菌素生物合成基因簇進行序列和功能分析，該基因簇全長82kb，共有18個開放閱讀框架。基因簇內(nèi)部有4個大的閱讀框架(AveA1-AveA2和AveA3-AveA4)，編碼多功能的聚酮體合成酶；aveC和aveE基因位于aveA1-aveA2和aveA3-aveA4基因之間，與聚酮體的修飾有關(guān)；在基因簇的右側(cè)鄰近aveA4的上游，是一套涉及齊墩果二糖的合成和轉(zhuǎn)移的8個基因(aveB?I-aveBV?III)；緊鄰aveA1的上游(左方)是編碼C5-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的aveD，負責將甲基轉(zhuǎn)給阿維菌素B的C5的OH上而形成阿維菌素A。aveF緊鄰aveD的下游，二者轉(zhuǎn)錄方向一致，可能屬于同一轉(zhuǎn)錄單位。aveF編碼C5酮基還原酶，催化阿維菌素B的生成。aveR位于aveF的下游(但轉(zhuǎn)錄方向相反)，屬于途徑特異性調(diào)控基因，是阿維菌素生物合成全基因簇的正調(diào)控基因。

在抗生素產(chǎn)生過程中基因水平的分子調(diào)控起著至關(guān)重要的作用，通過遺傳學方法對鏈霉菌進行改造，提高抗生素產(chǎn)量。主要是通過改造抗生素產(chǎn)生的調(diào)節(jié)基因來進行的，有既與抗生素生物合成相關(guān)又與形態(tài)分化相關(guān)的調(diào)控基因，如bldA，relC，relA等；也有參與抗生素生物合成的全局性調(diào)控基因，如absA，absB，afsR等；還有參與抗生素生物合成的特異性調(diào)控基因，如ActII-ORF4，aveR，dnrI，redD，sanG，ccaR等。對抗生素生物合成起正調(diào)節(jié)作用的基因，可以通過提高它在菌株中的拷貝數(shù)或者改變啟動子提高其表達量來提高抗生素的產(chǎn)量，對起負調(diào)節(jié)作用的基因，則可以通過敲除該基因來提高抗生素的產(chǎn)量。但是，通過提高拷貝數(shù)的方法得來的菌株往往穩(wěn)定性較差，因為高拷貝的遺傳載體往往不穩(wěn)定，容易丟失，若考慮到后期的工業(yè)生產(chǎn)，可能更多嘗試通過同源重組整合到染色體上，更加穩(wěn)定的維持高產(chǎn)相關(guān)基因在工程菌株的穩(wěn)定存在。對能同時調(diào)控多種抗生素產(chǎn)量的調(diào)節(jié)基因進行改造比改造只調(diào)控單一抗生素產(chǎn)量的調(diào)節(jié)基因更加有效。