[發明專利]一種提高亞油酸異構酶活性的方法

無效

• 申請號: 201010172827.2
• 申請日: 2010-05-14
• 公開（公告）號: CN102242108A
• 公開（公告）日: 2011-11-16
• 發明（設計）人: 阮暉;陳美齡;馬風蘭;陳赟;廖文艷;徐娟;王睿之;周陳偉;何國慶
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N9/90
• 分類號: C12N9/90;C12N15/81;C12R1/865
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

技術領域

本發明涉及一種生物工程領域，特別涉及一種在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)細胞壁外表面展露表達亞油酸異構酶以提高該酶活性的方法。

背景技術

共軛亞油酸是由必需脂肪酸亞油酸衍生的共軛不飽和雙鍵位于不同位置的18碳共軛雙烯酸幾何異構體的總稱。許多微生物能利用自身的亞油酸異構酶將亞油酸轉化成共軛亞油酸。但目前應用的亞油酸異構酶主要存在以下問題：酶的重組表達方式一般是細胞內表達和分泌表達。細胞內表達時由于酶不能與細胞外底物接觸，從而極大地影響酶的催化效率，而且酶分子集聚在細胞內形成反饋抑制，也影響表達效率。分泌表達的主要缺點是表達效率不高，而且也不能實現完全分泌表達，總有相當一部分表達產物滯留于細胞內，從而也不能實現酶與細胞外底物的完全接觸。這兩種表達方式都導致酶的催化效率不高。

本發明開發一種將亞油酸異構酶展露表達在釀酒酵母細胞壁外表面的技術，實現酶與細胞外底物的完全接觸，從而顯著提高亞油酸異構酶活性。

發明內容

針對現有的亞油酸異構酶催化效率低的問題，本發明提供一種將亞油酸異構酶展露表達在釀酒酵母細胞壁外表面的技術，實現酶與細胞外底物完全接觸，從而顯著提高亞油酸異構酶活性。

本發明的一種提高亞油酸異構酶活性的方法，包括以下步驟：將亞油酸異構酶基因(Genbank號：DQ227322)連接在釀酒酵母細胞壁成份α凝集素序列(Genbank號：M28164)的N端，然后插入釀酒酵母表達載體GAL1啟動子(Genbank號：AY428072)下游MFα1信號肽序列(Genbank號：M17301)的C端，構建成表達框，表達框從N端到C端：GAL1啟動子+MFα1信號肽序列+亞油酸異構酶基因+α凝集素序列；將包含該表達框的酵母質粒轉化入釀酒酵母細胞。

將包含上述表達框的釀酒酵母細胞培養于添加有3.5％(重量百分比)半乳糖和4-7.5％乳糖(重量百分比)的YPD培養基中。

本發明的優點：

將亞油酸異構酶展露表達在釀酒酵母細胞壁外表面，實現酶與細胞外底物的完全接觸，從而顯著提高亞油酸異構酶活性。

具體實施方式

以下通過實施例進一步對本發明進行描述：

本發明開發一種將亞油酸異構酶展露表達在釀酒酵母細胞壁外表面的技術，實現酶與細胞外底物的完全接觸，從而顯著提高亞油酸異構酶活性。

三種酶分子表達方式如下：

-：酶分子

細胞內表達????????分泌表達????????展露表達

實施例1亞油酸異構酶展露表達

將亞油酸異構酶基因(來自Lactobacillus?plantarum，Genbank號：DQ227322)連接在釀酒酵母細胞壁成份α凝集素序列(來自釀酒酵母Saccharomyces?cerevisiae，Genbank號：M28164)的N端，然后插入釀酒酵母表達載體GAL1啟動子(來自釀酒酵母表達載體pYES263，Genbank號：AY428072)下游MFα1信號肽序列(來自釀酒酵母Saccharomyces?cerevisiae，Genbank號：M17301)的C端，構建成表達框(從N端到C端)：GAL1啟動子+MFα1信號肽序列+亞油酸異構酶基因+α凝集素。將包含該表達框的酵母質粒轉化入釀酒酵母細胞(Saccharomyces?cerevisiae，購自安琪酵母股份有限公司)，則MFα1信號肽將引導亞油酸異構酶向釀酒酵母細胞外分泌，而亞油酸異構酶下游的α凝集素則錨定在釀酒酵母細胞壁中，從而使亞油酸異構酶展露表達在釀酒酵母細胞壁外表面。

實施例2亞油酸異構酶展露表達的誘導

在培養釀酒酵母的YPD培養基中，添加3.5％半乳糖(購自上海生工生物工程有限公司，Shanghai?Sangon?Biological?Engineering?Technology?&?ServicesCo.，Ltd.)和4-7.5％乳糖(購自上海生工生物工程有限公司，Shanghai?SangonBiological?Engineering?Technology?&?Services?Co.，Ltd.)，則表達框“GAL1啟動子+MFα1信號肽序列+亞油酸異構酶基因+α凝集素”中的GAL1啟動子就會活化，誘導亞油酸異構酶在釀酒酵母細胞壁外表面展露表達。

實施例3半乳糖和乳糖對亞油酸異構酶展露表達的作用