[發明專利]一種EV71病毒抗體的制備方法

無效

• 申請號: 201010172735.4
• 申請日: 2010-05-14
• 公開（公告）號: CN101863976A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發明（設計）人: 支旭勃;劉磊;郭海榮;王俊
• 申請（專利權）人: 珠海市英平生物科技有限公司
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C12N15/40;C12N15/63;C07K14/08
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 譚志強

技術領域

本發明涉及一種病毒抗體的制備方法，特別涉及一種EV71病毒抗體的制備方法。

背景技術

手足口病，英文名為：Hand-foot-and-mouth?disease，是由腸道病毒引起的傳染病，多發生于5歲以下兒童，可引起手、足、口腔等部位的皰疹，少數患兒可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等并發癥。個別重癥患兒如果病情發展快，會導致死亡。

引發手足口病的腸道病毒有20多種(型)，柯薩奇病毒A組的16、4、5、9、10型，B組的2、5型，以及腸道病毒71型均為手足口病較常見的病原體，其中以柯薩奇病毒A16型(CoxA16)和腸道病毒71型(EV71)最為常見。

手足口病是全球性傳染病，自1957年新西蘭首次發現此病以來，世界大部分地區均有此病流行的報導，且近幾年來每次爆發的規模跟持續的時間都在不斷增長。

我國自1981年在上海始見本病，以后北京、河北、天津、福建、吉林、山東、湖北、西寧、廣東等十幾個省市均有報導。此病每隔2-3年便會爆發一次，每年的4-8月份為該病的流行期。我國以EV71型病毒感染居多。

EV71病毒屬腸道病毒屬(Enterovirus)的成員，EV71病毒株SHZH98基因序列病毒基因組為7408個核苷酸的正鏈RNA，編碼約2194個氨基酸，其Genebank登記號為：AF302996.1，其序列如SEQ?ID?NO：1所示。

截止2009年4月份，全國已累計報告手足口病115618例，死亡50例，而此時該病才剛剛開始流行，還未達到高峰。

目前針還沒有針對該病的疫苗，治療上主要以預防為主，配合藥物治療，但是由于該病存在很多隱性感染，同時傳播速度快，傳播途徑多，所以預防和控制該病難度很大。加上感染的大部分是5周歲以下的小孩，病程短發病急，稍有不慎就有可能危機到小孩的生命，所以該病已被我國納入丙類傳染疾病進行管理。因此開發EV71病毒的多克隆卵黃抗體的研究，具有廣泛的社會需求和應用價值。

發明內容

本發明的目的在于提供一種EV71病毒抗體的制備方法。

本發明所采取的技術方案是：

一種EV71病毒抗體的制備方法，包括以下步驟：

1)設計含有不同酶切位點的上、下游引物，擴增EV71病毒株SHZH98的抗原決定序列；

2)將擴增得到的抗原決定序列克隆到載體上，構建重組質粒；

3)將重組質粒轉入細菌或真菌中進行表達，收集表達得到的抗原蛋白；

4)將抗原蛋白溶解，注射至動物體內，誘導動物產生抗體，收集、純化得到抗體，所述抗原決定序列為EV71病毒株SHZH98的2439bp-3329bp、1713bp-3329bp、2439bp-3779bp。

優選的，上、下游引物中的酶切位點為EcoRI、XhoI的酶切位點。

優選的，產生EV71病毒抗體的動物為禽類。

本發明方法制得的抗體，可以阻止EV71病毒的感染，具有預防和治療手足口病的功能。

本發明方法制得的抗體，可以直接添加在食品、保健品中，也可以阻止EV71病毒的感染，具有預防和治療手足口病的功能。

采用抗原免疫禽類產生抗體，可以直接收集禽類卵，大大降低了抗體提純的成本，制備速度快。

附圖說明

圖1是各抗體的免疫效果對比圖。

具體實施方式

下面結合實例，進一步說明本發明。

以下實施例中：

EV71病毒由第四軍醫大學西京醫院兒科惠贈，病毒分離自患兒咽拭子標本，檢測鑒定均參考國家手足口病標本采集及檢測技術方案，熒光定量PCR檢測為陽性后，感染細胞分離擴增保存。當然，也可以使用其他可公開獲得的EV71病毒，擴增得到本發明的抗原決定序列。

pGEX-4T1質粒、細菌BL21、大腸桿菌Rosetta，均由西北農林科技大學張智英教授惠贈。

將EV71病毒擴增，提取其總RNA，使用RT-PCR擴增所需片斷。

抗原制備實施例1

1)使用上游引物：CCCGAATTCGGAGATAGGGTGGCAGAT(SEQ?ID?NO：

5)，下游引物：CCCCTCGAGGAGAGTGGTGATCGCTGC(SEQ?ID?NO：

6)，采用TouchDown-PCR擴增與EV71病毒株SHZH98基因序列的2439bp-3329bp(SEQ?ID?NO：2)一致的片斷，片段大小891bp，上游引物中，GAATTC為EcoRI的酶切位點，下游引物中，CTCGAG為XhoI酶切位點；