[發明專利]高粱花葉病毒三抗夾心酶聯免疫吸附檢測試劑盒

無效

• 申請號: 201010172279.3
• 申請日: 2010-05-14
• 公開（公告）號: CN101852807A
• 公開（公告）日: 2010-10-06
• 發明（設計）人: 張仲凱;董家紅;蘇曉霞;丁銘;方琦;李婷婷;張麗珍
• 申請（專利權）人: 云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/531;C12N7/02;C07K16/10;C07K16/06
• 代理公司: 昆明正原專利代理有限責任公司 53100
• 代理人: 陳左

1.一種高粱花葉病毒三抗夾心酶聯免疫吸附檢測試劑盒，該試劑盒包括陽性對照、陰性對照、高粱花葉病毒多克隆抗體、高粱花葉病毒單克隆抗體、酶標抗體及其它材料和藥品，將陽性對照、陰性對照、高粱花葉病毒多克隆抗體、高粱花葉病毒單克隆抗體、酶標抗體及其它材料和藥品組裝得到試劑盒，所說的其它材料和藥品包括包被緩沖液、PBST，病毒抽提緩沖液、封閉緩沖液、底物緩沖液、底物、5塊酶標板及20個一次性滴管，其特征在于高粱花葉病毒多克隆抗體在分離提純高粱花葉病毒甘蔗分離物后，通過家兔免疫分離血清得到；高粱花葉病毒單克隆抗體在分離提純高粱花葉病毒甘蔗分離物后，通過小鼠免疫、細胞融合、克隆純化得到；

所述的高粱花葉病毒通過采集含有高粱花葉病毒的甘蔗病株樣品、經檢測提純得到；

采集檢測過程為：在田間采集甘蔗病株樣品，經電子顯微鏡和標準抗體檢測含有大量高粱花葉病毒，且只含有該病毒，樣品采集后放入-80℃冰箱中保存備用；

高粱花葉病毒提純的過程為：

感病甘蔗葉片，加PB抽提緩沖液，病葉與PB抽提緩沖液的重量體積比為1∶2，單位為克/毫升；電動攪拌機充分勻漿，雙層紗布過濾；濾液中加入20％氯仿，在4℃攪拌15min；在8000g離心力、4℃下離心15min；棄沉淀，收集上清液；上清液中加入其體積5％重量的工業級纖維素酶，單位為克/毫升，37℃攪拌溫育45min；在8000g離心力、4℃下離心15min；棄沉淀，收集上清液；上清液中加入6％PEG和3％NaCl，攪拌溶解后4℃靜置4h或過夜；在10000g離心力、4℃下離心20min；棄上清液，沉淀用PB抽提緩沖液充分懸浮洗滌；在10000g離心力、4℃下離心20min；收集上清液；沉淀重新懸浮離心3遍；合并上清液，在80000g離心力、4℃下離心120min；棄上清液，沉淀用PB抽提緩沖液充分懸浮洗滌；在10000g離心力、4℃下離心20min；收集上清液；沉淀重新懸浮離心3遍；合并上清液，上清液即為病毒粗提純液；清液加入加有10％-50％的蔗糖墊的離心管中，在80000g離心力、4℃下，水平離心120min；收集含有病毒層液體，在80000g離心力、4℃下離心120min；棄上清液，沉淀用0.02mol/L磷酸鹽緩沖液充分懸浮洗滌；沉淀懸浮液即為病毒精提純液；

所述的高粱花葉病毒多克隆抗體由以下過程制備得到：

1)選用2公斤以上健康雄性家兔作為免疫動物，將提純的高粱花葉病毒稀釋至1mg/ml，作為免疫抗原，4℃下保存；

2)進行免疫注射，將1ml提純的高粱花葉病毒加1ml福氏完全佐劑，充分混合，在家兔背部皮下多點注射，每點0.2ml；一周后，將1ml提純的高粱花葉病毒加1ml福氏完全佐劑，充分混合，家兔雙后足足墊注射，每點1ml；一周后，將1ml提純的高粱花葉病毒耳靜脈注射；一周后，取2ml提純的高粱花葉病毒，耳靜脈注射；7-10天后，心臟全采血，分離血清，得高粱花葉病毒多克隆抗體；

所述的高粱花葉病毒單克隆抗體由以下過程制備得到：

1)選用Bal?b/c小白鼠STU系3月齡雌鼠用作病毒免疫，并取它們的脾細胞作細胞融合，將高粱花葉病毒提純液稀釋至1mg/ml，作為免疫抗原，4℃下保存；

2)高粱花葉病毒單克隆抗體制備，提純的高粱花葉病毒免疫雌性小鼠，經細胞融合、ELISA篩選、克隆，生產和貯存，單克隆抗體亞類鑒定，純化，真空冷凍干燥，得高粱花葉病毒單克隆抗體。