[發(fā)明專利]博伊丁假絲酵母甲酸脫氫酶的原核表達載體及其構(gòu)建方法和應用

無效

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• 申請日: 2010-05-14
• 公開（公告）號: CN102277370A
• 公開（公告）日: 2011-12-14
• 發(fā)明（設計）人: 陳麗梅;張婧;李昆志
• 申請（專利權(quán)）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/53;C12N9/02
• 代理公司: 昆明今威專利代理有限公司 53115
• 代理人: 賽曉剛

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種高效表達博伊丁假絲酵母甲酸脫氫酶蛋白(FDH)的原核表達載體pET28a-FDH及其在FDH蛋白的原核表達和制備FDH重組蛋白中的應用。

背景技術(shù)

甲酸脫氫酶(FDH，EC?1.2.1.2)在有生命的生物體中廣泛分布，F(xiàn)DH催化甲酸氧化成二氧化碳并在此過程中還原NAD⁺成NADH。甲酸脫氫酶(FDH)是廣泛存在于甲基營養(yǎng)型細菌，酵母以及高等植物和動物中的一個酶家族。根據(jù)其四級結(jié)構(gòu)、輔基的存在和類型以及底物特異性，分為幾種不同的類型。其中一類是NAD⁺依賴的甲酸脫氫酶，催化甲酸離子氧化成二氧化碳，在NAD+的耦聯(lián)反應中形成NADH。該類型的甲酸脫氫酶由兩個相同的亞基組成，不含金屬離子和輔基，對甲酸和NAD⁺具有高度的專一性。

由于FDH反應的不可逆性以及能適應較寬的pH條件，這種酶在最適pH下對許多工序是一種多用途的高效生物催化劑，因此甲酸脫氫酶具有相當大的生物技術(shù)應用潛力。FDH可用于在有機合成中發(fā)展NAD+再生系統(tǒng)，用來生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品。德固賽公司(德國)最近開始使用商業(yè)技術(shù)制造叔丁基-L-亮氨酸，用FDH作為NADH再生的催化劑，這在藥物化學中是一個最大的酶法工藝。來源于耐熱微生物的FDH有較好的耐熱性能，因此具有很好的工業(yè)應用價值。微生物甲酸脫氫酶的研究特別受重視，其中研究最多的是甲基營養(yǎng)型細菌和酵母FDH的特性、結(jié)構(gòu)和催化機制等。

近年來，甲酸脫氫酶在輔酶再生中的應用已成為輔酶酶法再生研究領(lǐng)域的熱點之一。它主要應用于輔酶NADH的酶耦聯(lián)法再生系統(tǒng)中，所謂的酶耦聯(lián)就是利用2個平行的氧化還原反應酶系統(tǒng)，1個酶催化底物轉(zhuǎn)化，另1個酶則催化輔酶NADH循環(huán)再生。甲酸/甲酸脫氫酶體系是最成功的再生系統(tǒng)，它具有諸多優(yōu)點：(1)FDH容易得到，且適宜的pH范圍寬，易于實現(xiàn)再生反應與合成反應的有效耦合；(2)甲酸是最廉價的氫源之一；(3)甲酸在FDH作用下轉(zhuǎn)化為二氧化碳，可直接從產(chǎn)物中分離出去，使反應接近于不可逆過程；(4)甲酸的存在并不會影響體系中另一氧化還原酶的活性。甲酸脫氫酶在工業(yè)NADH再生中的應用已在酵母和細菌中被廣泛研究。

此外，甲酸脫氫酶還有相當大的農(nóng)學應用潛力。例如，F(xiàn)DH可用作診斷酶在溶液和生理體液中用于測定甲酸和草酸的含量。在研究多種脅迫條件對FDH的影響時，可產(chǎn)生一些抗脅迫植株，如抗旱和抗凍等，這在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有很大的應用價值。

博伊丁假絲酵母是一種甲基營養(yǎng)型酵母菌，能以甲醇為碳源生長，F(xiàn)DH催化甲醇氧化途徑的最后一步反應，在博伊丁假絲酵母的甲基營養(yǎng)生長中起很重的作用，來自博伊丁假絲酵母FDH是個由兩個性質(zhì)完全相同的亞基構(gòu)成的二聚體，每個亞基由364個氨基酸構(gòu)成，都有各自的活性中心。與其他生物的FDH相比，博伊丁假絲酵母FDH具有較高的活性(6U/mg蛋白)，對NAD和甲酸也具有較高的親和性(NAD的Km值為0.04mM，甲酸的Km值為2.4mM)，對熱穩(wěn)定性也比較好(Labrou和Rigden，Biochem.J.2001，354：455-463)，因此該酶可能具有較好的應用前景。

用較低的成本和簡便的方法快速生產(chǎn)并純化有活性的FDH蛋白是滿足其工業(yè)應用的必需條件，而FDH蛋白特異性抗體是檢測植物中FDH蛋白表達水平的有效工具。但現(xiàn)有研究中還未有制備博伊丁假絲酵母FDH的抗體報道。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的是提供一種FDH的原核表達載體(pET28a-FDH)，該載體含有T7啟動子和終止子、細菌核糖體結(jié)合位點和FDH基因及一個組氨酸標簽，利用該載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌(BL21)，可實現(xiàn)FDH蛋白的高水平表達。表達的重組蛋白質(zhì)40％為可溶性蛋白，用親和層析很容易從大腸桿菌可溶性總蛋白中純化出高純度的重組FDH蛋白質(zhì)，用于FDH酶制劑的生產(chǎn)以及生化特性分析。其余60％以包涵體形式存在，用高濃度的尿素溶解包涵體后，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離FDH蛋白，再從凝膠中回收FDH蛋白可得到純度極高的FDH蛋白，用于抗體的制備。FDH重組蛋白表達量很高，因此不需要大規(guī)模培養(yǎng)細菌，純化FDH蛋白的操作相當簡單，成本也很低，極易重復使用。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：

FDH的原核表達載體pET28a-FDH，該載體含有T7啟動子和終止子、細菌核糖體結(jié)合位點和FDH基因及一個組氨酸標簽。