[發明專利]一種提高脂肪酶活力持續性的方法

無效

• 申請號: 201010171802.0
• 申請日: 2010-05-14
• 公開（公告）號: CN102242088A
• 公開（公告）日: 2011-11-16
• 發明（設計）人: 阮暉;陳美齡;馬風蘭;廖文艷;陳赟;徐娟;王睿之;周陳偉;何國慶
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N9/20
• 分類號: C12N9/20;C12N15/81;C12R1/865
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

技術領域

本發明涉及一種生物工程領域，特別涉及一種在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)細胞壁外表面展露表達脂肪酶以提高該酶活力持續性的方法。?

背景技術

酯是一大類在化工、食品、醫藥等領域廣泛應用的重要產品或中間體，僅用作食用香料的酯即達數百種。各種酯的合成路線相同，均以羧基供體(如酸、酸酐)和羥基供體(如醇、淀粉等)為原料，通過酯化反應制備。?

脂肪酶能催化許多種酯的生物合成。與酯的化學合成相比，酯的生物合成具有效率更高、反應條件溫和、能耗低等優點。但目前應用的脂肪酶存在酶活力持續性不足這一問題。包括脂肪酶在內的各種酶的重組表達方式有細胞內表達和分泌表達兩種，這兩種酶的重組表達方式使酶分子與宿主細胞之間沒有關聯，即酶分子不是宿主細胞的組成部分，從而很容易失活。如果使酶分子成為細胞的有機組成部分，則只要細胞保持存活狀態酶分子也會保持活力，從而可以顯著提高酶的活力持續性。?

本發明開發一種使脂肪酶成為釀酒酵母細胞有機組成的技術，即將脂肪酶與釀酒酵母細胞壁成分FLO連接而成為釀酒酵母細胞的組成部分，只要釀酒酵母細胞保持存活則脂肪酶始終保持活性狀態，從而顯著提高了脂肪酶活力持續性。?

發明內容

針對現有的脂肪酶活力持續性不足的問題，本發明提供一種使脂肪酶成為釀酒酵母細胞有機組成部分的技術，使脂肪酶只要釀酒酵母細胞保持存活即可保持活力，從而顯著提高脂肪酶活力持續性。?

本發明的一種提高脂肪酶活力持續性的方法，包括以下步驟：?

將脂肪酶基因(Genbank號：AF229435)連接(常規方法)在釀酒酵母細胞壁成份FLO序列(Genbank號：S73336)的N端，然后插入(常規方法)釀酒酵母表達載體GAL1啟動子(Genbank號：AY428072)下游MF?α1信號肽序列(Genbank號：M17301)的C端，構建成表達框，表達框從N端到C端：GAL1?啟動子+MF?α1信號肽序列+脂肪酶基因+FLO序列；將包含該表達框的酵母質粒轉化入釀酒酵母細胞。?

將包含“權利要求1”所述表達框的釀酒酵母細胞培養于添加有4.2-6.8％(重量百分比)半乳糖(普通半乳糖)的YPD培養基中?

本發明的優點：將脂肪酶與釀酒酵母細胞壁成分FLO連接，如此則只要釀酒酵母細胞保持存活狀態，脂肪酶即可保持活力。?

具體實施方式

以下通過實施例進一步對本發明進行描述：?

實施例1脂肪酶展露表達?

將脂肪酶基因(來自Rhizopus?oryzae，Genbank號：AF229435)連接在釀酒酵母細胞壁成份FLO序列(來自釀酒酵母Saccharomyces?cerevisiae，Genbank號：S73336)的N端，然后插入釀酒酵母表達載體GAL1啟動子(來自釀酒酵母表達載體pYES263，Genbank號：AY428072)下游MF?α1信號肽序列(來自釀酒酵母Saccharomyces?cerevisiae，Genbank號：M17301)的C端，構建成表達框(從N端到C端)：GAL1啟動子+MF?α1信號肽序列+脂肪酶基因+FLO序列。將包含該表達框的酵母質粒轉化入釀酒酵母細胞(Saccharomycescerevisiae，購自安琪酵母股份有限公司)，則MF?α1信號肽將引導脂肪酶向釀酒酵母細胞外分泌，而脂肪酶下游的FLO序列則錨定在釀酒酵母細胞壁中，從而使脂肪酶展露表達在釀酒酵母細胞壁外表面。?

實施例2脂肪酶展露表達的誘導?

在培養釀酒酵母的YPD培養基中，添加4.2-6.8％半乳糖(購自上海生工生物工程有限公司，Shanghai?Sangon?Biological?Engineering?Technology&ServicesCo.，Ltd.)，則表達框“GAL1啟動子+MF?α1信號肽序列+脂肪酶基因+FLO序列”中的GAL1啟動子就會活化，誘導脂肪酶在釀酒酵母細胞壁外表面展露表達。?

實施例3半乳糖對脂肪酶展露表達的作用?

在培養釀酒酵母的YPD培養基中，如果不含半乳糖，則未檢測到脂肪酶活性，這是因為表達框“GAL1啟動子+MF?α1信號肽序列+脂肪酶基因+FLO序列”中的GAL1啟動子無法活化。?

實施例4脂肪酶展露表達后其活力持續性顯著提高?