[發(fā)明專利]一種HPA等位基因分型檢測試劑盒

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010170627.3
• 申請日: 2010-05-11
• 公開（公告）號: CN101845520A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發(fā)明（設計）人: 馮明亮;沈彤;劉達莊;趙玉林;劉熔增
• 申請（專利權）人: 上海市血液中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 上海光華專利事務所 31219
• 代理人: 許亦琳;余明偉

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種HPA等位基因分型檢測試劑盒。

背景技術

血小板是無核的血細胞，血小板的功能主要是促進止血和加速凝血，同時血小板還有維護毛細血管壁完整性的功能。血小板在止血和凝血過程中，具有形成血栓，阻塞創(chuàng)口，釋放和凝血有關的各種因子等功能。在血液快速流動的動脈和小動脈系統(tǒng)形成血栓的過程中，血小板起著核心作用。

血小板膜含有多種蛋白質，這些蛋白質連接有大量的碳水化合物支鏈而成為糖蛋白。血小板糖蛋白不僅對維持血小板形態(tài)和完整性非常重要，同時構成了血小板的各種受體，使血小板發(fā)揮止血及有關的功能。血小板糖蛋白基因發(fā)生變異時，可改變血小板糖蛋白結構和表達水平，進而影響血小板的黏附、聚集和血栓形成。

隨著分子生物學和單克隆抗體技術的發(fā)展，許多血小板糖蛋白的基因序列已得到證實，并使得對血小板糖蛋白多態(tài)性的深入研究成為可能。此后，在關于血小板糖蛋白的生物化學本質、功能及其分子生物學研究方面取得了巨大進步。血小板糖蛋白基因上存在人類血小板同種異型抗原系統(tǒng)(human?platelet?alloantigen，HPA)，每個抗原系統(tǒng)是由共顯性雙等位基因控制。對血小板糖蛋白IIIa和糖蛋白Ib的基因序列研究發(fā)現(xiàn)，在血小板糖蛋白IIIa基因的第2號外顯子上存在HPA-11a/1b等位基因，血小板糖蛋白I?b基因的受體結合區(qū)存在HPA-22a/2b等位基因。

血小板輸注在臨床上有著重要的作用。然而，由于血小板上存在特異性血小板抗原，臨床使用時往往因抗原不合而發(fā)生血小板輸注無效、輸血后紫癜等。更為嚴重的是，許多患者由于血小板減少，且輸注無效，影響了臨床治療的開展和進行，甚至發(fā)生出血、死亡。因此，在輸注血小板以前檢測受體和供體的特異性血小板抗原，有助于避免因抗原不合而造成的不良后果。另外，近年來不斷有文獻報道血小板抗原與一些疾病的關聯(lián)。如HPA-1、HPA-2、HPA-15等位基因多態(tài)性與心肌梗塞和缺血性腦血管病顯著相關。因此，快速而準確地檢測HPA抗原系統(tǒng)對臨床個性化治療、醫(yī)學研究和新型抗血栓藥物-血小板糖蛋白抑制劑的開發(fā)和評價具有重要意義。

現(xiàn)有技術中已知共有6對HPA抗原系統(tǒng)：HPA-1、HPA-2、HPA-3、HPA-4、HPA-5和HPA-15，每個系統(tǒng)包括a/b一對等位基因。在中國人群中，HPA-1～5和HPA-15具有較高的多態(tài)性，HPA不配合輸注極易引發(fā)同種抗體的產生。因此，開發(fā)一種快速、精準的HPA-1～5、15基因分型試劑盒可有效推進血小板同型輸注，為血小板同種免疫反應(疾病)的治療提供幫助。

目前在普通實驗室進行HPA分型的方法主要有：序列特異引物聚合酶鏈式反應(PCR-SSP)、序列特異性寡核苷酸聚合酶鏈式反應(PCR-SSO)、直接測序分型聚合酶鏈式反應(PCR-SBT)、限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈式反應(PCR-RFLP)等，這些方法都有其各自的局限性，上述各方法的原理及其缺陷如下所示：

1)PCR-SSP

主要原理：設計出一套特異性針對各等位基因的引物，直接擴增有序列差異的各等位基因特異性片斷，通過瓊脂糖電泳來判斷有無擴增產物來確定基因的多態(tài)性；

主要實驗流程：設計序列特異性引物→擴增→瓊脂糖凝膠電泳→觀察；

實驗缺陷：無法自動獲取結果；一對等位基因需要雙管操作；特異性引物的先天不足導致非特異性的產生，準確度有待提高。

2)PCR-SSO

主要原理：利用標記的等位基因特異性的指示物一寡核苷酸探針與所含目的SNP片段進行雜交，然后使用發(fā)光或產色底物來進行檢測；

主要試驗流程：擴增→產物連接尼龍膜支持物→標記特異性探針雜交；

實驗缺陷：雜交溫度須嚴格控制；洗滌條件嚴格；易產生假陽性及假陰性。

3)PCR-SBT

主要原理：根據(jù)核苷酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的堿基處終止，并且在每個堿基后面進行熒光標記，產生以A、T、C、G結束的四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測，從而獲得可見的DNA堿基序列；

主要試驗流程：目的片段擴增→產物純化→測序；

實驗缺陷：實驗成本高。

4)PCR-RFLP

主要原理：基于SNP所致的目標基因上限制性酶切位點的丟失或獲得，相關基因片斷通過SNP的5′端和3′端的引物進行擴增，產物用限制性酶進行降解，然后進行聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳并分析；

主要試驗流程：目的片段擴增→產物酶解→電泳觀察；