[發(fā)明專利]水通道蛋白4-siRNA干擾序列及其融合表達(dá)載體和該表達(dá)載體的醫(yī)藥用途

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010170350.4
• 申請(qǐng)日: 2010-05-12
• 公開（公告）號(hào): CN102242117A
• 公開（公告）日: 2011-11-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 谷峰;馬勇杰;丁婷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/63;A61K48/00;A61P35/00;A61P35/04;A61P25/00
• 代理公司: 天津市宗欣專利商標(biāo)代理有限公司 12103
• 代理人: 董光仁

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是用于抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞浸潤和擴(kuò)散的水通道蛋白4-siRNA干擾序列及其融合表達(dá)載體和該表達(dá)載體的醫(yī)藥用途。?

背景技術(shù)

轉(zhuǎn)錄后的基因沉默是進(jìn)化過程中一種抵御轉(zhuǎn)錄子和RNA病毒的防御機(jī)制，在植物和動(dòng)物分化之前就已經(jīng)出現(xiàn)。1998年華盛頓卡耐基研究院的Andrew?Fire和馬薩諸塞大學(xué)癌癥中心的CraigMello首次將雙鏈dsRNA(double-stranded?RNA)注入線蟲，結(jié)果誘發(fā)了比正義鏈和反義鏈的單獨(dú)注射都要強(qiáng)的基因沉默。將這種由dsRNA引發(fā)的特定基因表達(dá)受抑制現(xiàn)象稱為RNA干擾作用(RNA?interferenee?RNAi)。?

RNA干擾是由雙鏈RNA所引起的序列特異性基因沉默，是真核生物中一種非常保守的機(jī)制，它與協(xié)同抑制、轉(zhuǎn)錄子沉默以及發(fā)育等許多重要的生物學(xué)過程密切相關(guān)。RNA干擾依賴于小干擾RNA(Small?interferenceRNA，siRNA)與靶序列之間嚴(yán)格的堿基配對(duì)，具有很強(qiáng)的特異性，涉及眾多基因和蛋白復(fù)合物，構(gòu)成了一個(gè)以小RNA為核心的真核基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，它可以在染色質(zhì)水平、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平參與基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。RNA干擾技術(shù)為人們迅速、準(zhǔn)確的剖析基因的功能，分析基因之間錯(cuò)綜復(fù)雜的聯(lián)系和相互作用提供了極為有用的工具，同時(shí)也為人們預(yù)防和治療癌癥和病毒疾病提供了新的思路，例如：研究信號(hào)傳導(dǎo)通路和基因功能RNAi能夠在哺乳動(dòng)物中降低特異性基因的表達(dá)，制作多種表型，而且抑制基因表達(dá)的時(shí)間，控制基因表達(dá)的部位，以開展基因治療的新途徑。?

惡性膠質(zhì)瘤是一類惡性程度極高的惡性腫瘤，占顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的40％和中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤78％。惡性膠質(zhì)瘤向周圍正常腦組織侵襲浸潤是其致死的主要原因，盡管現(xiàn)代的診斷和治療技術(shù)已經(jīng)有了長(zhǎng)足的發(fā)展，其中位生存時(shí)間仍然不超過15個(gè)月。迄今為止惡性膠質(zhì)瘤侵襲浸潤的分子機(jī)制，尚未完全明確。?

水通道蛋白分子(AQP)4是含有6個(gè)跨膜域的疏水性膜蛋白，廣泛分布于機(jī)體組織細(xì)胞中，尤其在與液體分泌和吸收有關(guān)的上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中含量豐富，AQP4能夠參與調(diào)節(jié)水的分泌、吸收及細(xì)胞內(nèi)外水的平衡。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明是為了解決惡性膠質(zhì)瘤病人腫瘤細(xì)胞浸潤和擴(kuò)散問題，而提供一種水通道蛋白4-siRNA干擾序列及其融合表達(dá)載體和該表達(dá)載體的醫(yī)藥用途。?

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：設(shè)計(jì)針對(duì)AQP4的siRNA片段，通過siRNA基因敲除技術(shù)靶向抑制AQP4的表達(dá)，制備AQP4-siRNA融合表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)染到惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株LN-229中，用免疫印記等方法檢測(cè)到細(xì)胞中的AQP4的表達(dá)水平降低，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞株進(jìn)行一系列細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)，確定AQP4-siRNA融合表達(dá)能夠降低腫瘤細(xì)胞的浸潤和擴(kuò)散能力。?

應(yīng)用Qiagen?Plasmid?Maxi試劑盒提取純化AQP4-siRNA融合表達(dá)載體質(zhì)粒，確保無內(nèi)毒素污染，用無RNA酶水溶解載體，終濃度為10μg/ml，-80℃凍存，備用。?

因此，本發(fā)明設(shè)計(jì)并合成一段水通道蛋白4-siRNA干擾序列，該序列兩端分別帶有BamH?I和Bbs?I酶切位點(diǎn)，該序列的堿基序列及siRNA作用位點(diǎn)如下：5’-GGCTGGCT?TGGAGGAGAATTA-3’。?

一種水通道蛋白4-siRNA干擾序列的融合表達(dá)載體，其水通道蛋白4-siRNA融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)染惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株LN-229中后，能夠特異的降解與其互補(bǔ)的水通道蛋白4-mRNA，降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞株LN-229中水通道蛋白4的表達(dá)，有效的抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移，粘附以及侵襲能力，該融合表達(dá)載體的堿基序列見序列表。?

水通道蛋白4-siRNA干擾序列的融合表達(dá)載體在制備抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞擴(kuò)散和浸潤藥物中的應(yīng)用：?

a.水通道蛋白4-siRNA干擾序列的融合表達(dá)載體抑制人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外遷移能力；?

b.水通道蛋白4-siRNA干擾序列的融合表達(dá)載體抑制人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外粘附能力，侵襲能力；?

c.水通道蛋白4-siRNA干擾序列的融合表達(dá)載體抑制腫瘤擴(kuò)散和侵襲浸潤。?

這樣設(shè)計(jì)的本發(fā)明具有的有益效果：?

1.AQP4-siRNA融合表達(dá)載體能夠抑制惡性膠質(zhì)瘤LN-229細(xì)胞的體外遷移能力，趨化能力。?

2.AQP4-siRNA融合表達(dá)載體能夠抑制惡性膠質(zhì)瘤LN-229細(xì)胞的體外粘附能力，侵襲能力。?