[發(fā)明專利]一種以肝癌相關(guān)基因DLK1為靶點的核糖核酸及其用途

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010170084.5
• 申請日: 2006-12-11
• 公開（公告）號: CN101812454A
• 公開（公告）日: 2010-08-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 韓澤廣;黃健
• 申請（專利權(quán)）人: 上海人類基因組研究中心
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;A61K48/00;A61P35/00;A61P1/16
• 代理公司: 上海浦一知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31211
• 代理人: 王函

該申請是以下專利申請的分案申請：申請?zhí)枮?00610119409.0，申請日為2006年12月11日，發(fā)明名稱為“肝癌相關(guān)基因DLK1及其應用”。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學和基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及肝癌相關(guān)基因DLK1、以其mRNA序列為靶點的一組siRNA、及其在制備診斷肝癌試劑、制備基因治療肝癌的藥物中的應用。

背景技術(shù)

目前我國有慢性肝炎患者約1200萬例，每年死于肝病約30萬，其50％為原發(fā)性肝癌，約占全世界肝癌死亡人數(shù)的45％左右。絕大多數(shù)與HBV、HCV感染有關(guān)。肝癌發(fā)病率在我國居2-3位，主要在青壯年男性發(fā)病，在華東地區(qū)的發(fā)病率明顯高于其他地區(qū)，近年來，有持續(xù)上升趨勢。在上海，肝癌的發(fā)病率居第三位，僅次于肺癌和胃癌。最新資料顯示這個比例還有繼續(xù)上升的趨勢。現(xiàn)在，肝癌，特別是肝炎病毒引起的肝癌已經(jīng)嚴重危害了我國人民生命安全。因此，非常有必要對肝癌發(fā)生的分子機制作深入的研究。

隨著人類基因組測序的完成，基因組學的研究重點已經(jīng)轉(zhuǎn)移到以解析基因功能為主的功能基因組學研究。功能基因組學的重點是以疾病為中心，全力解決人類疾病相關(guān)基因研究中的重大科學問題。肝癌在我國素有“國病”之稱，經(jīng)過半個世紀的探索，對于肝癌的早期診斷和治療雖然有了一定的認識，但肝癌預后仍然很差，特別是對其發(fā)病機制的了解及治療藥物的新靶點方面，更是知之甚少。因此，尋找與腫瘤相關(guān)的基因，特別是尋找新的抑癌基因是近年來腫瘤研究的熱點。DLK1基因定位于染色體14q32上。DLK1是在胞外區(qū)域包含6個EGF樣重復序列的糖基化Delta樣跨膜蛋白。DLK1首先是在脂肪前體細胞中發(fā)發(fā)現(xiàn)，與脂肪細胞的分化緊密相關(guān)。DLK1基因具有抑制脂肪前體細胞向脂肪細胞分化的功能。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)DLK1在神經(jīng)母細胞瘤細胞和小細胞肺癌細胞株等腫瘤細胞中存在表達，表明DLK1基因可能與腫瘤發(fā)生相關(guān)；同時在老鼠的胎肝細胞和膽汁淤積引起的肝纖維化細胞中均發(fā)現(xiàn)DLK1的表達。在我們的前期肝癌及癌旁表達譜分析的研究中，發(fā)現(xiàn)DLK1基因在肝癌中的表達較癌旁組織中明顯增加，提示DLK1基因可能對肝癌的發(fā)生相關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種肝癌相關(guān)基因DLK1的mRNA序列，蓋基因定位在人染色體14q32上，可用于制備治療原發(fā)性肝癌的RNA干擾藥物。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供肝癌相關(guān)基因DLK1的mRNA序列。

本發(fā)明還提供一種表達載體，含有所述以DLK1上mRNA為靶點的siRNA序列。

本發(fā)明還提供一種含有所述表達載體的宿主細胞。

在本發(fā)明的再一方面，還提供了一種用于治療肝癌的試劑盒，其含有所述的以DLK1上mRNA為靶點的siRNA。

在本發(fā)明的又一方面，還提供了一種用于治療肝癌的生物芯片，其含有以DLK1上mRNA為靶點的siRNA。

在本發(fā)明的又一方面，還提供了肝癌相關(guān)基因DLK1在制備診斷肝癌及腫瘤的試劑，和制備基因治療肝癌及腫瘤的藥物中的應用。

本發(fā)明由于對DLK1基因進行了體外動物細胞試驗，證實DLK1缺失能夠?qū)е赂文[瘤細胞顯著縮小，認為DLK1基因在進行制備治療肝癌的基因藥物中有巨大作用，可以成為基因治療的靶點。

附圖說明

圖1是實施例1中pSUPER?DLK874和pSUPER?DLK1011的RNA干擾效率示意圖，其中，pSUPER為空載對照，pSUPER?Luc+為陰性對照；

圖2是實施例2中三次克隆實驗中的一次的實驗照片；

圖3是實施例2中從上到下為Hep3B、HepG2和Huh-7細胞在三次獨立實驗中的克隆數(shù)目統(tǒng)計圖，其中，*表示與對照組比較時p值＜0.05；

圖4是實施例3中DLK1表達穩(wěn)定下調(diào)的Huh-7細胞株的鑒定示意圖，其中，β-actin作為各樣品蛋白上樣量對照；

圖5是實施例3中DLK1表達穩(wěn)定下調(diào)Huh-7細胞株的生長曲線比較示意圖，其中，細胞活力在450nm波長處測量，每點上下所標的黑色刻度線標志為其標準差；

圖6是實施例4中DLK1表達下調(diào)的Huh-7細胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤性降低示意圖；上圖為4周后攜帶腫瘤的裸鼠照片，皮下的腫瘤呈圓塊狀；下圖為4周后取下的皮下腫瘤照片，其中Huh-7p1011A4細胞在六周后仍無腫瘤形成；

圖7是實施例5中SMMC-7721瞬間轉(zhuǎn)染pcDNA3.0和pcDNA3.0-DLK1后的生長曲線示意圖；