[發明專利]斑馬魚P-選擇素基因及其編碼蛋白與應用

無效

• 申請號: 201010169969.3
• 申請日: 2010-04-27
• 公開（公告）號: CN101831433A
• 公開（公告）日: 2010-09-15
• 發明（設計）人: 劉可春;孫桂金;王雪;王思鋒;王希敏
• 申請（專利權）人: 山東省科學院生物研究所
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C07K14/46;A61K48/00;A61K38/17;A61P7/02;A01K67/027
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 趙會祥

技術領域

本發明涉及一種來源于斑馬魚的P-選擇素基因及其編碼蛋白與應用，屬基因工程技術領域。

背景技術

P-選擇素亦稱CD62P，顆粒膜蛋白140(granular?membrane?protein?140，GMP140)，或血小板活化依賴性顆粒表面膜蛋白(platelet?activation?dependent?granule?external?membraneprotein，PADGEM)，是選擇素家族的重要黏附分子。

P-選擇素貯存于內皮細胞的Weibel-Palade小體和血小板的α顆粒中，正常內皮細胞和血小板表面無P-選擇素表達或呈持續低表達狀態，當細胞受刺激(LPS、組胺、血栓素、ADP、TNF-α等)活化后，P-選擇素分泌到細胞表面。

對血栓性心腦血管疾病的研究發現，血小板的活化在此類疾病的發生發展中起著非常重要的作用。活化后血小板膜表面的許多糖蛋白，如P-選擇素、GPIIb-IIIa等表達量發生顯著變化，其中P-選擇素是近年來所認識的最具特異性的血小板活化的分子標記物。P-選擇素作為血小板/內皮細胞活化標志和細胞黏附受體，它可通過介導血小板、內皮細胞黏附及與白細胞的相互作用，啟動并參與包括炎癥發生和血栓形成等多種病理生理起始過程，是炎癥/血栓的重要介質和靶分子。

由于P-選擇素在血栓形成中起重要作用，針對其的檢測和抗粘附治療已成為診斷和治療血栓性疾病的重要手段。以P-選擇素及其配體為靶點來防治心腦血管疾病日益受到國內外的關注，抗P-選擇素及其配體治療則有望成為心血管疾病干預的新靶點。

斑馬魚已成為生物學研究的最佳脊椎動物模型之一。斑馬魚產卵周期短，產卵量大，早期胚胎和仔魚完全透明，可以動態觀察體內血液循環，心臟跳動和其它器官形成。斑馬魚基因組測序結果表明，斑馬魚的基因與人類的基因保守度達到85％，使得斑馬魚成為一種研究人類疾病的模式動物，越來越受到人們的關注。同時，斑馬魚胚胎發育遺傳學技術的逐步建立和完善也為斑馬魚人類疾病模型的建立和分析提供了良好的基礎。斑馬魚在與人類疾病相關的基因及其功能和人類疾病模型的研究中已顯示出重要的意義。目前，利用斑馬魚作為整體動物模型進行高通量的篩選已成為斑馬魚研究的熱點之一。

基于已知疾病機制而建立的斑馬魚模型在幾個領域快速發展，包括血液病、糖尿病、肌肉萎縮、神經萎縮、血管生成和脂類代謝障礙。由于斑馬魚早期胚胎和仔魚完全透明，易觀察血小板(又稱血栓細胞)的形成和凝結等現象。因此，斑馬魚非常適用于血栓性疾病的研究。斑馬魚的轉基因技術已經相對成熟，很多轉基因斑馬魚品系被建立，然而與血栓癥和血小板相關的轉基因斑馬魚品系卻很少。

人、大鼠、小鼠等高等脊椎動物的P-選擇素已被先后克隆。在低等脊椎動物中關于P-選擇素研究方面的報道極少。迄今為止，斑馬魚P-選擇素基因的研究尚未見報道。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供一種斑馬魚P-選擇素基因及其編碼蛋白與應用。

斑馬魚(Danio?rerio)P-選擇素基因，具有如SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列。

該P-選擇素基因cDNA序列全長2800bp，有一個2607bp開放閱讀框架，5′端非編碼區長111bp，3′端非編碼區長82bp，有多聚腺苷酸加尾信號和多聚腺苷酸尾巴。

由斑馬魚(Danio?rerio)P-選擇素基因編碼的蛋白質，具有如SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列。蛋白保守結構域分析顯示，該蛋白具有哺乳動物選擇素家族分子膜外區3種結構域：1個C型凝集素樣結構域，1個表皮生長因子樣結構域，10個重復的補體結合蛋白結構域。

原位雜交實驗證實，P-選擇素基因在斑馬魚的循環系統表達，48小時的表達量比24小時高。

實時定量RT-PCR結果表明，促血小板活化物質ADP明顯的促進P-選擇素基因的表達。這表明斑馬魚P-選擇素基因在血栓形成中起重要作用。

本發明的P-選擇素基因，可用于構建轉基因斑馬魚，構建的轉基因斑馬魚可用于研究血栓類疾病的發病機理，篩選預防和治療血栓類疾病的藥物。本發明的斑馬魚P-選擇素基因及其編碼蛋白也可用于制備預防和治療血栓類疾病的藥物。

附圖說明

圖1是P-選擇素基因在24和48小時斑馬魚胚胎表達的整體原位雜交結果

(A)P-選擇素基因在24小時斑馬魚胚胎的循環系統表達

(B)P-選擇素基因在48小時胚胎的循環系統表達

圖2是ADP促P-選擇素表達的實時定量RT-PCR結果

*表示處理組與對照組有顯著差異