[發明專利]保持病毒活性的高通量切向流分離海洋藻類病毒的方法

有效

• 申請號: 201010169514.1
• 申請日: 2010-05-10
• 公開（公告）號: CN101831409A
• 公開（公告）日: 2010-09-15
• 發明（設計）人: 楊季芳;吳慶喜;程凱;陳吉剛
• 申請（專利權）人: 楊季芳
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00
• 代理公司: 寧波誠源專利事務所有限公司 33102
• 代理人: 張一平

技術領域

本發明涉及海洋浮游病毒的分離技術領域，尤其指一種保持病毒活性的高通量切向流分離海洋藻類病毒的方法。

背景技術

Bergh?O等早在1989年就研究發現，在海洋生態系統中，病毒和浮游植物是其重要的一類生物，對海洋生態系統具有重要的調節作用。病毒在海水表層中大量存在會造成宿主的死亡從而導致海洋初級生產力的下降，McDaniel?L等(2002)已證實藻類病毒能夠調節水生態系統中的藻細胞密度。藻類病毒所特有的生態功能，暗示藻類病毒可能會成為將來的一種新型的生物防治有害藻類水華的手段，這種可能性已被越來越多的研究者所肯定。Bratbak?G等(1993)的研究證實藻類病毒作為水生態系統中的重要組成部分，能夠引起一些有害藻類細胞的裂解死亡，對有害藻華起到一定的控制作用。Nagasaki?K等(1999)的研究證實了用赤潮異彎藻病毒HaV01作為一種微生態制劑來控制此類有害藻華的可能性。

我國在藻類病毒方面的研究報道為數不多，田波等(1998)用空斑法(Plaque?FormingUnits，PFU)對小球藻病毒進行了分離報道；趙以軍等(2002)采用小型反向超濾濃縮(Backflushing?Ultrafiltration)裝置對淡水藍藻病毒(噬藻體)首次進行了分離報道。相比較而言，PFU法只適用于能在固體培養基上生長的藻類病毒的分離，而大部分的藻類(尤其是海洋藻類)是不能在固體培養基上培養的，因此就不能采用此方法進行分離；反向超濾濃縮法只適用于小量體積淡水水樣的濃縮處理，相對于海水大量體積樣品的濃縮處理而言是不適宜的。目前就我國藻類病毒的研究報道來看，只有淡水藻類病毒的幾例分離報道，海洋藻類病毒的分離報道為數甚少。因此，如果想尋求用海洋藻類病毒來治理赤潮的新方法，藻類病毒的分離工作顯得尤為重要。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的現狀提供一種保持病毒活性的高通量切向流分離海洋藻類病毒的方法。

本發明所要解決的另一個技術問題是針對現有技術的現狀提供一種用于保持病毒活性的高通量切向流分離海洋藻類病毒的方法中所使用的切向流膜包的清洗和保存方法。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：該保持病毒活性的高通量切向流分離海洋藻類病毒的方法，其特征在于包括下述步驟：

1)在4～8℃的低溫和暗室條件下進行一級過濾：

首先用0.2μm的濾芯對海水樣品進行預過濾處理：調節蠕動泵的泵速在90～100rpm之間，去除直徑大于0.2μm的非病毒性顆粒或細菌，得到預處理后的海水樣品；整個操作在4～8℃的暗室條件下進行；

然后用切向流膜包對預處理后的海水樣品進行超濾濃縮處理：調節蠕動泵的泵速在110～120rpm之間；首先關閉透過液閥門，打開回流液閥門，然后慢慢開啟透過液閥門，調節回流液閥門至如下參數：進水壓P_inlet＝1～2ba，回流壓P_outlet＝0.5～1ba，按原樣∶濃縮樣體積比1000～500∶1進行濃縮，對預處理后的海水樣品反復進行切向流滲透，獲得粗濃縮病毒液；

2)在無菌、4～8℃和暗室條件下進行二級過濾：

首先用0.1％～0.5％(M/V)的小牛血清白蛋白潤濕0.22μm無菌針頭式過濾器，在該過濾器中對粗濃縮病毒液進行二級過濾，進一步去除直徑大于0.22μm的非病毒性顆粒和一級過濾操作中可能污染的雜菌，得到純度較高的濃縮病毒液；其中小牛血清蛋白的濃度是指將一定克數的小牛血清蛋白溶解在以毫升為單位的純凈水中得到的；

3)特異性海洋藻病毒的分離：

用經二級過濾的濃縮病毒液，對預先培養的不同種類的海洋藻細胞進行反復的液體感染，即可建立藻病毒-宿主藻的特異性系統，分離出與濃縮病毒液中具有特異性的海洋藻類病毒。

所述的切向流膜包在使用前最好先進行潤濕，具體操作如下：

用純凈水潤濕膜包，純凈水的用量大于等于10L/10^-1m²膜包表面積；調節蠕動泵的泵速在100～110rpm之間；首先關閉透過液閥門，打開回流液閥門，然后慢慢開啟透過液閥門，調節回流液閥門至如下參數：進水壓P_inlet＝1～2ba、回流壓P_outlet＝0.5～1ba、滲透壓P_per＝0ba；循環流動潤濕膜包，直到純凈水全部滲透流出。

所述的切向流膜包在超濾濃縮后進行清洗，清洗方法如下：