[發明專利]豬鏈球菌噬菌體穿孔素的制備方法

無效

• 申請號: 201010168940.3
• 申請日: 2010-05-12
• 公開（公告）號: CN101831442A
• 公開（公告）日: 2010-09-15
• 發明（設計）人: 孫建和;李寧;嚴亞賢;史一博;陸承平
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/33
• 分類號: C12N15/33;C12N15/70;C07K14/005
• 代理公司: 上海交達專利事務所 31201
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

1.一種豬鏈球菌噬菌體穿孔素的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一，純化得到豬鏈球菌2型烈性噬菌體，提取噬菌體的DNA；

步驟二，以步驟一所得DNA為模板，應用PCR擴增穿孔素基因；

步驟三，原核表達步驟二擴增所得DNA，得到融合蛋白；

步驟四，純化融合蛋白，復性，得到穿孔素。

2.根據權利要求1所述的豬鏈球菌噬菌體穿孔素的制備方法，其特征是，步驟三中，所述原核表達采用的質粒是pET-28a(+)，表達的穿孔素分子約16kDa。

3.根據權利要求1或者2所述的豬鏈球菌噬菌體穿孔素的制備方法，其特征是，步驟三中，所述的原核表達是指：

(1)根據豬鏈球菌烈性噬菌體SMP的基因序列設計引物進行PCR擴增，連接到pMD-18T載體上測序，所設計的引物上游包含EcoR?I限制性酶切位點，下游包含Xho?I限制性酶切位點；

(2)表達載體的構建：EcoR?I和Xho?I分別酶切PCR產物和pET-28a(+)，T4?DNA連接酶10～16℃過夜連接，連接產物轉入大腸桿菌DH5α中，37℃過夜培養，提取質粒，用EcoRI和Xho?I酶切鑒定，鑒定的陽性重組質粒測序；

(3)融合蛋白的表達：篩選陽性克隆提取質粒，挑取1個菌落接種5ml卡那霉素LB培養基過夜培養，取5mL過夜培養菌液接種1L卡那霉素LB培養基，37℃200轉/分搖菌培養5h，至OD₆₀₀為0.4～1，加異丙基硫代-β-D-半乳糖苷至終濃度為1mM，27℃搖菌培養4h后，收取菌液；

(4)配制12％的分離膠和5％的濃縮膠，樣品用上樣緩沖液沸水煮4min，濃縮膠電壓80V，分離膠電壓136V，電泳4～5h，考馬斯亮蘭染色2h，脫色觀察，在16kDa處有明顯的條帶出現。

4.根據權利要求1所述的豬鏈球菌噬菌體穿孔素的制備方法，其特征是，步驟三中，所述的融合蛋白是指獲得一個分子量為16kDa的融合蛋白。

5.根據權利要求1所述的豬鏈球菌噬菌體穿孔素的制備方法，其特征是，步驟四中，所述的純化融合蛋白是指經過Ni柱純化，得到有活性的穿孔素。

6.根據權利要求1或者5所述的豬鏈球菌噬菌體穿孔素的制備方法，其特征是，步驟四中，所述的純化融合蛋白，包括如下步驟：

①IPTG誘導的細菌1L溶于25mL預冷的裂解緩沖液，其中含50mM磷酸鈉緩沖液，pH8.0，超聲破碎；

②8000g離心取上清；

③以8個柱體積的裂解緩沖液洗Ni柱，將樣品上至柱內，再用預冷的裂解緩沖液洗柱，直至OD₂₈₀＜0.1；

④用預冷的裂解緩沖液加5mM咪唑的清洗緩沖液A洗柱，直至OD₂₈₀＜0.1；

⑤用預冷的裂解緩沖液加20mM咪唑的清洗緩沖液B洗柱，直至OD₂₈₀＜0.1；

⑥最后用裂解緩沖液加250mM咪唑的溶出液洗柱，收集洗脫液，即為純化的穿孔素。

7.根據權利要求1或者5所述的豬鏈球菌噬菌體穿孔素的制備方法，其特征是，所述的步驟四中的穿孔素發揮最佳裂解作用的條件是：采用pH5.2醋酸鈉緩沖液、最佳反應溫度是37℃。

8.根據權利要求1所述的豬鏈球菌噬菌體穿孔素的制備方法，其特征是，所述的步驟二按照以下方式進行：

在重懸液中加入20mg/mL蛋白酶K至終濃度50μg/mL，37℃溫育30分鐘；

再加10％SDS至終濃度為0.5％，混勻后將消化混合物于56℃溫育1小時，冷卻至室溫；

用等體積酚/氯仿抽提，3000g離心5分鐘將兩相分開，將親水相收集至另一個離心管中；

在回收的親水相中加入3mol/L乙酸鈉至終濃度0.3mol/L，混勻后加兩倍體積的無水乙醇輕輕洗滌，13000g離心2分鐘，棄上清，回收DNA沉淀；

用核酸溶解緩沖液溶解噬菌體DNA。