[發(fā)明專利]一種濃縮純化肝素的生產(chǎn)工藝

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010168046.6
• 申請日: 2010-05-11
• 公開（公告）號: CN101831009A
• 公開（公告）日: 2010-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 來海中;趙文軍;盧耀勤;嚴(yán)歡
• 申請（專利權(quán)）人: 新疆立實(shí)生物科技有限公司
• 主分類號: C08B37/10
• 分類號: C08B37/10;C12S3/02
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1.一種濃縮純化肝素的生產(chǎn)工藝，其特點(diǎn)在于，采用擴(kuò)張柱床離子交換樹脂法可將豬、牛、羊等哺乳動物的小腸粘膜、肝、肺臟等臟器的組織勻漿的提取液不經(jīng)過預(yù)處理直接采用色譜技術(shù)分離、濃縮、純化肝素的生產(chǎn)技術(shù)，還可用于粗品肝素的精制，改變了使用傳統(tǒng)的離子交換固定柱床吸附技術(shù)原料液中不能含有不溶性顆粒的限制。其原理在于吸附介質(zhì)顆粒在向上流動的液體的作用下膨脹起來，吸附介質(zhì)顆粒在床體中均勻的懸浮，并按照不同的顆粒尺寸和密度形成梯度而有續(xù)的排列，形成一個均衡、穩(wěn)定的吸附環(huán)境，液體中的目標(biāo)肝素被吸附于介質(zhì)上，而細(xì)胞、細(xì)胞碎片、雜蛋白、核酸及雜多糖和其他的組織碎片將通過柱子而流出去，洗脫目標(biāo)肝素時從相反方向?qū)⑽浇橘|(zhì)壓緊，再用洗脫緩沖液將目標(biāo)肝素洗下來。擴(kuò)張柱床色譜技術(shù)兼有流化床和填充床的優(yōu)點(diǎn)，不需預(yù)先除去料液中的顆粒而可以直接從料液中吸附目標(biāo)產(chǎn)物。從而起到有效的吸附分離作用。擴(kuò)張柱床離子交換色譜技術(shù)不但可用于從哺乳動物臟器勻漿液直接提取肝素，還可用于粗品肝素的精制。采用擴(kuò)張柱床離子交換色譜技術(shù)從哺乳動物臟器勻漿液直接提取肝素和用粗品肝素精制肝素，大大降低了肝素純化工藝的復(fù)雜性，提高了產(chǎn)率，降低了生產(chǎn)成本。改變以往的國內(nèi)樹脂法精制肝素的生產(chǎn)中，基本上都是采用分批吸附的方法。分批吸附法理論塔板數(shù)低，柱效損失大，純化效率低，對目的分子吸附不夠充分，因此損失大。采用擴(kuò)張柱床離子交換色譜技術(shù)提取肝素，可將肝素與雜質(zhì)蛋白、核酸及其余硫酸多糖分離，濃縮，純化一次完成。減少工序，縮短時間，降低成本，提高效率和質(zhì)量。采用擴(kuò)張柱床離子交換色譜技術(shù)直接從勻漿液中提取肝素，肝素單位效價達(dá)到120U/mg以上，用粗品精制肝素，效價達(dá)到160U/mg以上，產(chǎn)品中紫外區(qū)雜質(zhì)(260nm，280nm)均滿足藥典要求；

技術(shù)內(nèi)容：

(1)哺乳動物小腸粘膜的勻漿液經(jīng)堿鹽水解、胰蛋白酶酶解(豬牛羊等哺乳動物的肝臟肺臟的組織勻漿液加入0.1-0.5％木瓜蛋白酶)、高溫變性和過濾處理，經(jīng)過在一定離子濃度和PH條件下進(jìn)行擴(kuò)張柱床吸附層析法吸附、濃縮、純化肝素，乙醇沉淀，丙酮脫水，低溫干燥。

(2)粗品肝素經(jīng)堿鹽水和胰蛋白酶處理、高溫變性和過濾處理，后經(jīng)過在一定離子濃度和PH條件下進(jìn)行擴(kuò)張柱床吸附層析法吸附、濃縮、純化肝素，乙醇沉淀，丙酮脫水，低溫干燥。工藝流程

粗品制備：

a)豬、牛、羊等哺乳動物的小腸粘膜或肝、肺等臟器的組織勻漿液50g左右加水至250L，加入NaCI至1％-8％，攪拌、靜置、過濾。腸粘膜濾液加入0.1-0.5％胰蛋白酶(肝臟肺臟的組織勻漿液加入0.1-0.5％木瓜蛋白酶)。

b)在pH7.5-10.5，35-45℃下酶解數(shù)小時，NaOH調(diào)pH至8.0-10.0，升溫至50-55℃，保溫2-4h，不斷攪拌，然后快速升溫到92-95℃，保持10-15min，趁熱用80目濾網(wǎng)過濾，濾液(I)備用。

c)擴(kuò)張床柱Streamline50(5cm內(nèi)徑)、(購自Amersham?Pharmacia?Biotech(瑞典))裝入已處理好的強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂。控制溫度40-60℃，用蠕動泵將pH為7.5-10.5，適量MTris-HCl緩沖液自柱床底部泵入，使樹脂擴(kuò)張并保持平衡。

保持pH值不變，將適量濾液(I)加MTris-HCl緩沖液配制成NaCI為2-6％，pH為7.5-10.5的溶液，用蠕動泵通進(jìn)擴(kuò)張交換柱中先平衡樹脂，然后反復(fù)進(jìn)行離子交換，流速約為每小時2倍柱床體積，直至流出液檢驗(yàn)無肝素，全部吸附在樹脂上為止。

d)然后配制適量的的2-6％氯化鈉溶液，MTris-HCl緩沖液調(diào)節(jié)pH3-5，以2～3個沉積床體積的緩沖液平衡/擴(kuò)張柱床后，以5-6倍沉積床體積的緩沖液除雜，整個過程控制溫度15-25℃，流速約為每小時2.5柱床體積。

e)關(guān)掉蠕動泵，使D254樹脂重新沉積，調(diào)節(jié)活塞至剛好在沉積床的表面，然后以向下的液流和沉積床的狀態(tài)進(jìn)行洗脫。樹脂先用約4倍柱床體積的3-8％的氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。再用約2倍柱床體積的2-7％氯化鈉溶液(用量先多后少)同法洗脫2次。合并全部洗脫液，調(diào)節(jié)pH為6。

f)按洗脫液體積加入1.0倍量的預(yù)冷乙醇，沉淀過夜。

g)次日吸除乙醇。沉淀物用2％氯化鈉溶液溶解，調(diào)pH至6.0。按溶液體積加0.7倍乙醇，沉淀過夜。

h)次日虹吸上清乙醇，取出沉淀物。沉淀物依序用無水乙醇、丙酮洗滌脫水。真空干燥后得肝素，效價為120U/mg以上。

精品制備：

a)將效價為60-100U/mg左右的肝素粗品以1∶10的比例溶于3％的氯化鈉溶液中，然后再用2％的氫氧化鈉溶液調(diào)pH至8-11，于室溫靜置數(shù)小時，真空抽濾，去沉淀物，濾液待用。

b)在上述清液中加入0.01-0.1％胰蛋白酶，在pH7-10，35-45℃酶解數(shù)小時，升溫98-100℃，10-15min，趁熱真空抽濾，濾液備用。

c)擴(kuò)張床柱Streamline50(5cm內(nèi)徑)、(購自Amersham?Pharmacia?Biotech(瑞典))裝入已處理好的強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂，用蠕動泵將pH7-10，適量MTris-HCl緩沖液自柱床底部泵入，使樹脂擴(kuò)張并保持平衡。

d)控制溫度40-60℃，將適量濾液加MTris-HCl緩沖液配制pH為7.5-10.5的溶液，用蠕動泵通進(jìn)擴(kuò)張交換柱中反復(fù)進(jìn)行離子交換，交換過程中保持pH值與溫度恒定，流速約為每小時2倍柱床體積，直至流出液檢驗(yàn)無肝素，全部吸附在樹脂上為止。

e)然后配制適量的預(yù)冷的2-6％氯化鈉溶液，MTris-HCl緩沖液調(diào)節(jié)pH1-3，以2～3個沉積床體積的緩沖液平衡/擴(kuò)張柱床后，以5-6倍沉積床體積的緩沖液除雜，整個過程控制溫度2-5℃，流速約為每小時2.5柱床體積。

f)關(guān)掉蠕動泵，使樹脂重新沉積，調(diào)節(jié)活塞至剛好在沉積床的表面，然后以向下的液流和沉積床的狀態(tài)進(jìn)行洗脫。樹脂先用用約4倍柱床體積的2-6％氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。再用約2倍柱床體積的2-6％氯化鈉溶液(用量先多后少)同法洗脫2次。合并全部洗脫液，調(diào)節(jié)pH為6。

g)按洗脫液體積加入1.0倍量的預(yù)冷乙醇，沉淀過夜。

h)次日吸除乙醇。沉淀物用2％氯化鈉溶液溶解，調(diào)pH至6.0。按溶液體積加0.7倍乙醇，沉淀過夜，

i)次日虹吸上清乙醇，取出沉淀物。沉淀物依序用無水乙醇、丙酮洗滌脫水。真空干燥后得精品肝素，效價為150U/mg以上；

如權(quán)利要求1所述：擴(kuò)張柱床離子交換色譜技術(shù)的原料為豬、牛、羊等哺乳動物的小腸粘膜、肝、肺臟等臟器和粗品肝素；