[發(fā)明專利]用標(biāo)記探針進(jìn)行檢測(cè)和熔解曲線分析的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010166995.0
• 申請(qǐng)日: 2010-05-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101871007A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-10-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 富國(guó)良
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 無(wú)錫銳奇基因生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 杭州裕陽(yáng)專利事務(wù)所(普通合伙) 33221
• 代理人: 江助菊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種采用標(biāo)記探針進(jìn)行核酸檢測(cè)和熔解曲線分析的技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及采用雙標(biāo)記寡核苷酸探針對(duì)含有至少一個(gè)突變核苷酸的靶核酸序列進(jìn)行分析的方法。

背景技術(shù)

Real-time?PCR可以用來(lái)檢測(cè)和定量靶核酸序列。如今許多以探針為基礎(chǔ)的方法應(yīng)用于real-time?PCR中，例如TaqMan探針(U.S.Pat.Nos.5,210,015?and?5,487,972)，分子信標(biāo)探針(molecularbeacons，U.S.Pat.Nos.5,925,517?and?6,103,476)，自我檢測(cè)擴(kuò)增子(self-probing?amplicons)，也稱scorpions(U.S.Pat.No.6,326,145)，Amplifluor(Chen?et?al.，Appl.Environ.Microbiol.64：4210-6，1998)，Amplifluor(U.S.Pat.No.6,117,635)，置換雜交探針(Li?et?al.，Nucleic?Acids?Res.30：E5，2002)，DzyNA-PCR(Todd?et?al.，Clin.Chem.46：625-30，2000)，熒光限制性內(nèi)切酶檢測(cè)(Cairns?et?al.Biochem.Biophys.Res.Commun.318：684-90，2004)，相鄰雜交探針(U.S.Pat.No.6,174,670和Wittwer?et?al.，Biotechniques?22：130-1，134-8，1997)等。總而言之，熒光標(biāo)記的探針提高了靶序列定量的特異性。

關(guān)于基因型多態(tài)性和稀有突變的檢測(cè)已經(jīng)申請(qǐng)了很多專利。突變的檢測(cè)對(duì)于病理性突變的早期診斷是非常重要的，尤其是對(duì)于癌癥和耐藥的突變檢測(cè)更為重要。近年來(lái)報(bào)到了很多檢測(cè)突變的方法，期間基于real-time?PCR技術(shù)鑒別等位基因的方法也得到了發(fā)展，兩種主要的技術(shù)已被廣泛應(yīng)用。其中一種主要技術(shù)為，熒光信號(hào)是在每個(gè)PCR循環(huán)的結(jié)束時(shí)通過(guò)探針的雜交或水解產(chǎn)生的，例如TaqMan探針和分子信標(biāo)探針技術(shù)。熒光檢測(cè)一定是在PCR過(guò)程中或結(jié)束時(shí)。這些技術(shù)由于等位基因的特異性而需要使用兩條探針，其中一條探針對(duì)應(yīng)第一個(gè)等位基因，另外一條探針對(duì)應(yīng)第二個(gè)等位基因。另外一種主要技術(shù)為，通過(guò)熔解曲線分析來(lái)檢測(cè)突變，同樣通常需要兩條探針進(jìn)行熔解曲線分析，例如鄰近雜交探針。近年來(lái)，出現(xiàn)了一種單標(biāo)記探針(U.S.Pat.No.6,635,427)。較高的熒光背景和對(duì)序列特異核苷酸的依賴讓單標(biāo)記探針具有一定的局限性。基于雙標(biāo)記TaqMan探針的熔解曲線分析方法也有報(bào)道(Housni?et?al.，2003)。然而，這個(gè)報(bào)道中的標(biāo)記TaqMan探針的檢測(cè)方法也有其局限性。首先，它使用了具有5’核酸酶活性的Taq聚合酶，為了防止發(fā)生常規(guī)TaqManreal-time?PCR延伸步驟中探針的水解，所選探針的熔解溫度(Tm值)要比PCR引物的Tm值低10℃，由于探針的Tm值較低，因此探針的雜交效率也較低，而造成最終的熒光檢測(cè)信號(hào)也比較弱，探針的Tm值較低也就意味著探針較短，這就使得探針沒(méi)有辦法覆蓋到靶序列較長(zhǎng)的距離，這對(duì)于檢測(cè)一個(gè)基因核心區(qū)域的一連串突變是很不利的，例如TB耐藥中RpoB基因的核心區(qū)域；其次，以TaqMan探針為基礎(chǔ)的熔解曲線分析一般不適用于長(zhǎng)探針，由于報(bào)告標(biāo)記和猝滅標(biāo)記被長(zhǎng)距離的核苷酸所隔離，而使報(bào)告標(biāo)記和猝滅標(biāo)記無(wú)法相互作用。對(duì)于一個(gè)長(zhǎng)的TaqMan探針，很難檢測(cè)到探針雜交狀態(tài)和處于單鏈狀態(tài)時(shí)熒光強(qiáng)度的差異。在現(xiàn)有的技術(shù)方法中，TaqMan?real-time?PCR方法可以在每個(gè)循環(huán)實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)，但通常不能進(jìn)行熔解曲線分析。Housni等報(bào)道的改進(jìn)后的基于TaqMan的方法，當(dāng)探針遇到合適的條件時(shí)能夠進(jìn)行熔解曲線分析，但不能在每個(gè)循環(huán)實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)。基于分子信探針的方法可以在每個(gè)循環(huán)實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)，但不能對(duì)探針與靶序列雜交的混合物進(jìn)行熔解曲線分析。鄰近雜交探針可以進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)和熔解曲線分析，但同時(shí)需要兩條探針，一條探針用于錨定，另外一條探針用于報(bào)告。

這就需要一種改進(jìn)的探針用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)和/或進(jìn)行熔解曲線分析，同時(shí)也需要一種可以覆蓋包含多個(gè)突變位點(diǎn)的靶序列較大區(qū)域的探針。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種用標(biāo)記探針進(jìn)行檢測(cè)和熔解曲線分析的方法。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案：

首先，提供一種從樣本中檢測(cè)靶核酸序列的方法，包括：