[發明專利]一種新型親和介質的制備方法及其應用

無效

• 申請號: 201010164881.2
• 申請日: 2010-04-30
• 公開（公告）號: CN101869827A
• 公開（公告）日: 2010-10-27
• 發明（設計）人: 李瑩;劉治平;欒升
• 申請（專利權）人: 北京九州泰康生物科技有限責任公司
• 主分類號: B01J20/281
• 分類號: B01J20/281;B01J20/30
• 代理公司: 北京法思騰知識產權代理有限公司 11318
• 代理人: 高宇;楊小蓉

技術領域

本發明涉及生物化學領域，具體地，涉及一種新型親和介質的制備方法及其應用。

背景技術

親和層析法是分離蛋白質等生物活性物質最有效的純化方法，是利用生物分子間所具有的專一親和力而設計的層析技術。利用親和層析載體固相化配基與親和互補物之間通過范德華力、疏水力、靜電力、氫鍵等作用發生專一性的結合而進行分離。這種有選擇性地結合主要歸結于固相化配基與親和互補物二者之間的生物學特性和特異的化學結構以及空間構象。在親和層析過程中，被純化的生物分子在一定的條件下，選擇性地結合到被共價偶聯到不溶性載體上的配基上，然后改變原有的條件，如洗脫液pH值、離子強度、有機溶劑的濃度等，有選擇性地從載體上把被分離物洗脫下來。通過親和層析法分離的物質，其純度、活性回收率及純化倍數均較高。

親和層析的載體必須具備以下幾個特點：①不溶于水，但高度親水；②惰性物質，非特異性吸附少；③具有相當量的化學基團可供活化；④理化性質穩定；⑤機械性能好，具有一定的顆粒形式以保持一定的流速；⑥通透性好，最好為多孔的網狀結構，使大分子能自由通過；⑦能抵抗微生物和醇的作用。目前常用的載體是瓊脂糖膠粒。它具有機械強度高、透性好、載體本身非特異性吸附少等優點。如Pharmacia公司的Sepharose-4B、6B是目前應用較多的基質。但是，由于這些載體技術掌握在國外一些大公司的手中，價格十分昂貴，機械強度不夠高，難以實現大規模蛋白質純化。

玻璃具有理化性質穩定、非特異性吸附少、機械強度高、材料易得、易制備等特性。目前，玻璃板作為DNA和蛋白質的固定基質應用于生化和生物芯片領域；玻璃粉具有價格低廉，通透性好，難與其他物質發生反應等特點，但其僅用于食品、建筑、工業等領域，未用于生物化學領域。本發明將玻璃粉經過表面處理，偶聯上特殊物質，制作成層析介質用于生物物質的分離，為玻璃粉的應用開辟了一條嶄新的途徑，也為生物物質的分離提供了一種有效、價廉的方法。

發明內容

本發明利用玻璃粉價格低廉，流通性好，難與其他物質發生反應等特點，將其直接用作親和介質，可以避免許多其他介質如需添加溴化氰等劇毒物的缺點，更加環保，便于操作，保障了科研人員的身體健康。

因此，本發明的目的是提供一種新型親和介質。

本發明的另一目的是提供上述新型親和介質的應用。

根據本發明的新型親和介質，其中所述親和介質的固相載體為玻璃粉。

根據本發明的親和介質，其中，所述玻璃粉的粒徑范圍為0.1-1000μm、優選1μm、10μm、50μm、或200μm。

玻璃粉的表面必須經過修飾處理才能夠結合上蛋白質。這種修飾處理是指在玻璃粉表面鏈接上不同的活性基團，從而進一步形成具有不同活性的基團，來固定各種生物大分子如蛋白質、多肽、酶、抗原、抗體、DNA甚至細胞。玻璃粉的修飾處理主要包括清洗和活化兩部分，清洗的同時可以使玻璃粉帶上富含羥基的活性表面。活化試劑修飾得到含有氨基、巰基或羥基的活化表面，這種表面即可直接與生物大分子連接。活化后的玻璃粉表面根據所連接的基團的不同分為氨基玻璃粉，環氧基玻璃粉，醛基玻璃粉，巰基玻璃粉等。

當使用本發明的親和介質固定不同的生物大分子或細胞時，根據分離物的特性，本領域普通技術人員基于公知常識和現有技術可以選擇適當的活化試劑處理玻璃粉表面，以使其表面連接合適的活性基團，從而制備得到氨基玻璃粉，環氧基玻璃粉，醛基玻璃粉，巰基玻璃粉等。例如：

一、制備氨基玻璃粉

1、將玻璃粉用1M的NaOH浸泡2小時；

2、將玻璃粉浸泡于1％3-氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇中，搖床上室溫搖1小時；

3、95％乙醇清洗兩次，離心甩干；

4、150℃真空烘干；

二、制備醛基玻璃粉

1、將上述氨基玻璃粉放入到含有12.5％的戊二醛磷酸緩沖液中室溫搖3小時，洗凈；

2、150℃真空烘干；

使用這種方法固定的醛基可與蛋白質的氨基通過形成碳-氮鍵結合，從而實現與蛋白質相連。

三、環氧基玻璃粉

1、將玻璃粉用1M的NaOH浸泡2小時；

2、將玻璃粉浸泡于1％3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷[3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane，GPTMS]的甲醇中，搖床上室溫搖1小時；

3、95％甲醇清洗兩次，離心甩干；

4、150℃真空烘干。

使用這種方法在玻璃表面引入環氧乙烷基團，最后與氨基發生反應生成仲胺，從而實現與蛋白質相連。