[發明專利]特異序列基礎的水通道蛋白4高效價抗體的制備及應用

無效

• 申請號: 201010164851.1
• 申請日: 2010-05-07
• 公開（公告）號: CN101830983A
• 公開（公告）日: 2010-09-15
• 發明（設計）人: 李曉萌;張淑芝;汪小莞;關新剛;楊南揚;麻彤輝
• 申請（專利權）人: 東北師范大學
• 主分類號: C07K16/16
• 分類號: C07K16/16;C12N15/62;C12N15/70;C07K19/00;G01N33/53
• 代理公司: 長春市東師專利事務所 22202
• 代理人: 劉延軍;修雪靜

1.特異序列基礎的原核表達GST-AQP4融合蛋白的多克隆抗體，其特征在于利用特異序列原核表達的GST-AQP4融合蛋白作為抗原免疫動物產生抗血清而獲得，該抗血清中抗GST-AQP4抗體的滴度高達1∶50000，并經過Western?blot和免疫組化鑒定抗GST-AQP4血清具有較好的特異性，其中，所述的特異序列是指AQP4基因近3′端親水區的一段序列，其氨基酸序列為：

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核苷酸序列為：

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2.如權利要求1所述的原核表達GST-AQP4融合蛋白的多克隆抗體的制備方法，其特征在于利用GST表達系統獲得GST-AQP4融合蛋白，再經免疫兔獲得抗GST-AQP4抗血清，具體包括四步：

第一步，PCR-PMD18-T/AQP4重組質粒的構建，小鼠AQP4基因全長從Genebank得到，基因序列號為NM009700，以p8p64為模板，上游引物為5’-GAATTCGACAACCGGAGCCAAGTG，含EcoR1酶切位點；下游引物為5’-CTCGAGTACGGAAGACAATACCTC，含XhoI酶切位點，擴增得到的片段與PMD18-T載體連接，將連接產物轉入感受態大腸桿菌DH5α中，在含Amp+瓊脂平板上挑選克隆，以堿裂解法小提重組質粒后，以EcoR?I和Xhol?I雙酶切鑒定并測序；

第二步，原核表達載體pGEX-4T-1的構建，將含有AQP4基因近3′端親水區片段的pMD18-T質粒經EcoR?I和Xho1雙酶切后，利用回收試劑盒獲得AQP4基因該區片段，同時用相同的酶處理質粒pGEX-4T-1，然后將回收的AQP4基因近3′端親水區片段和經酶切的載體pGEX-4T-1在T4?DNA連接酶作用下于16℃連接過夜，酶切鑒定重組體，并且測序進一步確定；

第三步，GST-AQP4融合蛋白的誘導表達和純化，重組質粒PGEX-4T-1/AQP1轉化大腸桿菌BL21，挑取單菌落接入LB/Ampr培養基中，37℃振搖培養過夜，次日，將培養物按1∶50的比例轉接于含Amp+的LB培養基中，繼續在37℃搖床培養至對數生長中期，在培養液的A600為0.5～0.6時，加入IPTG至終濃度為0.08mmol/L，不加入IPTG者為陰性對照，置25℃繼續培養4～5h，離心收集菌體，以SDS-PAGE進行鑒定GST-AQP4融合蛋白的表達，并優化表達條件，進行大量擴增誘導，以5000r/min于4℃離心5min，收集菌體，用60mL冰預冷的NETN懸浮1L菌液的沉淀，用超聲裂解細菌，再以9600rpm，于4℃離心15min，取上清，過Glutathione-Sepharose?4B柱，先以等體積洗脫緩沖液1，含20mM谷胱甘肽、50mM?Triscl，pH＝8.0，洗脫，收集洗脫液，再以等體積洗脫緩沖液2，含100mM谷胱甘肽，洗兩遍，收集洗脫液，SDS-PAGE鑒定純化產物；

第四步，兔抗AQP4抗血清的制備及免疫學檢測，以純化的AQP4融合蛋白免疫雄性新西蘭大白兔，初次免疫用500μg融合蛋白，與等體積的完全弗氏佐劑充分混勻乳化后背部皮下多點注射，免疫前取耳靜脈血分離血清，作為免疫前的血清對照，2wk后進行第1次加強免疫，500μg純化的GST-AQP4融合蛋白與不完全弗氏佐劑等體積混勻，前后四腳掌肌肉注射，之后每隔2wk加強免疫1次，于末次免疫后1wk取耳血，用ELISA法測定抗體的效價，當抗體效價達到1∶100000時，頸動脈放血，收集血清，采用間接ELISA方法測定血清抗體的效價，并采用Western?blot方法分析抗AQP4血清特異性，將純化的融合蛋白GST2LZP3樣品，經SDS-PAGE分離后再電轉移至硝酸纖維素膜上，以5％脫脂奶粉封閉1h，依次滴加兔抗鼠LZP3抗血清，室溫2h、PBS洗3次，山羊抗兔IgG2HRP，室溫反應1h、PBS洗滌3次，最后加底物DAB顯色，并拍照。

3.如權利要求1所述的GST-AQP4融合蛋白的原核表達的多克隆抗體在檢測水通道蛋白4(AQP4)和深入研究水通道蛋白4(AQP4)功能中的應用。