[發明專利]一種昆蟲幾丁質合成酶1基因片段及其dsRNA和應用

有效

• 申請號: 201010163625.1
• 申請日: 2010-04-30
• 公開（公告）號: CN101818159A
• 公開（公告）日: 2010-09-01
• 發明（設計）人: 張建珍;劉曉健;馬恩波;楊美玲;郭亞平
• 申請（專利權）人: 山西大學
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N15/113;A01N61/00;A01P7/04
• 代理公司: 山西五維專利事務所(有限公司) 14105
• 代理人: 楊耀田

技術領域

本發明涉及生物技術領域。具體涉及昆蟲幾丁質合成酶1基因片段及其dsRNA和dsRNA致死害蟲中的應用。

背景技術

農業害蟲為害是我國農業產量的重要制約因素，長期施用化學殺蟲劑導致一系列問題：1)昆蟲出現抗藥性，用藥劑量加大，防治成本提高；2)農藥殘留導致環境污染嚴重；3)對非靶標生物有較大影響。現有生物殺蟲劑在害蟲防治中應用較廣，但殺蟲時間較長且效果緩慢。

RNA干擾(RNAi)是一種由雙鏈RNA分子引起的特異性轉錄后基因沉默現象，2006年獲諾貝爾獎。RNAi的發現不僅為基因的功能研究提供了方法上的突破，同時也為人類疾病治療和作物害蟲防治開辟了新的途徑。2007年，“Nature?Biotechnology”雜志先后兩篇論文報道了施用表達靶向害蟲重要致死基因V-ATPase?A，CYP6AE14?and?GST1的dsRNA轉基因植物作為一種控制病蟲害的新方法(Baum?et?al，2007；Mao?et?al，2007)。2008年，Price和Gatehouse提出了基于RNAi的害蟲防治策略。基于RNA干擾技術的害蟲防治具有如下優勢：1)選擇對害蟲專一的基因進行干擾，對高等動物和人類是安全的；2)抗蟲具有專一性，對非靶標生物無殺傷作用；3)對環境無毒無害。

研究表明，RNA干擾技術能夠有效控制特殊的植物害蟲，在害蟲防治領域具有重要的發展前景。而實現基于RNAi進行害蟲有效控制的關鍵是篩選對昆蟲高效致死的dsRNA。

幾丁質合成和代謝是昆蟲等節肢動物特有的生物學現象，由于人類和其它高等動物沒有幾丁質，因此昆蟲幾丁質合成系統已被公認為新型殺蟲劑作用的靶標。幾丁質合成酶在昆蟲幾丁質合成的最后一步起著關鍵作用，采用RNA干擾技術，開展幾丁質合成酶dsRNA在害蟲防治中的應用具有重要意義。

發明內容

本發明的目的是提供一種昆蟲幾丁質合成酶1基因片段及其dsRNA和dsRNA在致死害蟲中的應用。

本發明提供的一種昆蟲幾丁質合成酶1基因片段，其核苷酸序列是SEQ?ID?NO：1。

本發明提供的一種昆蟲幾丁質合成酶1基因片段獲得的方法，根據NCBI數據庫中登錄號分別為GU067730和GU067731的兩條幾丁質合成酶序列的共同部分，設計上游引物序列為SEQ?ID?NO：2，下游引物序列為SEQ?ID?NO：3，通過PCR擴增獲得SEQ?ID?NO：1。

以昆蟲幾丁質合成酶1基因片段為模板，通過試劑盒合成dsRNA。

dsRNA在致死害蟲中的應用：注射dsRNA到昆蟲體腔，結果表明：dsRNA可以特異性地沉默昆蟲體內幾丁質合成酶1基因的mRNA表達，昆蟲蛻皮困難死亡。

附圖說明

圖1：2齡東亞飛蝗若蟲注射dsRNA后對昆蟲生長發育的影響。(1為注射dsGFP的對照組，2和3均為注射dsRNA的實驗組)。注射dsRNA的實驗組昆蟲因蛻皮困難死亡。

圖2：2齡東亞飛蝗若蟲注射dsRNA后對幾丁質合成酶1(LmCHS1)基因轉錄的影響。β-actin為內參基因(1為注射dsGFP的對照組，2為注射dsRNA的實驗組)。

具體實施方式

實施例1：東亞飛蝗幾丁質合成酶1基因片段及其dsRNA的獲得

1)東亞飛蝗幾丁質合成酶1基因片段的獲得

根據NCBI數據庫中登錄號分別為GU067730和GU067731的兩條幾丁質合成酶基因序列的共同部分，采用primer?premier5.0軟件設計特異性引物，上游引物序列為SEQ?ID?NO：2，下游引物序列為SEQ?ID?NO：3，所有引物均由上海英濰捷基生物有限公司合成。選取大小一致雌雄各半東亞飛蝗5齡若蟲，四頭一組，冷凍于液氮中，待提取RNA，提取RNA的具體操作步驟參照TaKaRa?Trizol試劑盒。M-MLV反轉錄酶將所提RNA反轉錄成第一鏈cDNA，以此為模板，PCR擴增獲得幾丁質合成酶1基因片段，SV?Gel?and?PCRClean-Up?System(Promega)試劑盒將所獲幾丁質合成酶1基因片段進行純化。

2)東亞飛蝗幾丁質合成酶1基因片段合成的dsRNA的獲得