[發(fā)明專利]一種昆蟲幾丁質(zhì)合成酶2基因和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010163618.1
• 申請日: 2010-04-30
• 公開（公告）號: CN101831445A
• 公開（公告）日: 2010-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張建珍;劉曉健;馬恩波;郭亞平;張建琴
• 申請（專利權(quán)）人: 山西大學(xué)
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N9/00;C12N15/113;A01N61/00;A01P7/04
• 代理公司: 山西五維專利事務(wù)所(有限公司) 14105
• 代理人: 楊耀田

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及昆蟲幾丁質(zhì)合成酶2基因及其dsRNA和dsRNA致死害蟲中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

農(nóng)業(yè)害蟲為害是我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)量的重要制約因素，長期施用化學(xué)殺蟲劑導(dǎo)致一系列問題：1)昆蟲出現(xiàn)抗藥性，用藥劑量加大，防治成本提高；2)農(nóng)藥殘留導(dǎo)致環(huán)境污染嚴(yán)重；3)對非靶標(biāo)生物有較大影響。現(xiàn)有生物殺蟲劑在害蟲防治中應(yīng)用較廣，但殺蟲時間較長且效果緩慢。

RNA干擾(RNAi)是一種由雙鏈RNA分子引起的特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，2006年獲諾貝爾獎。RNAi的發(fā)現(xiàn)不僅為基因的功能研究提供了方法上的突破，同時也為人類疾病治療和作物害蟲防治開辟了新的途徑。2007年，“Nature?Biotechnology”雜志先后兩篇論文報道了施用表達(dá)靶向害蟲重要致死基因V-ATPase?A，CYP6AE14?and?GST1的dsRNA轉(zhuǎn)基因植物作為一種控制病蟲害的新方法(Baum?et?al，2007；Mao?et?al，2007)。2008年，Price和Gatehouse提出了基于RNAi的害蟲防治策略。基于RNA干擾技術(shù)的害蟲防治具有如下優(yōu)勢：1)選擇對害蟲專一的基因進(jìn)行干擾，對高等動物和人類是安全的；2)抗蟲具有專一性，對非靶標(biāo)生物無殺傷作用；3)對環(huán)境無毒無害。

研究表明，RNA干擾技術(shù)能夠有效控制特殊的植物害蟲，在害蟲防治領(lǐng)域具有重要的發(fā)展前景。而實(shí)現(xiàn)基于RNAi進(jìn)行害蟲有效控制的關(guān)鍵是篩選對昆蟲高效致死的dsRNA。

幾丁質(zhì)合成和代謝是昆蟲等節(jié)肢動物特有的生物學(xué)現(xiàn)象，由于人類和其它高等動物沒有幾丁質(zhì)，因此昆蟲幾丁質(zhì)合成系統(tǒng)已被公認(rèn)為新型殺蟲劑作用的靶標(biāo)。幾丁質(zhì)合成酶在昆蟲幾丁質(zhì)合成的最后一步起著關(guān)鍵作用，采用RNA干擾技術(shù)，開展幾丁質(zhì)合成酶dsRNA在害蟲防治中的應(yīng)用具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種昆蟲幾丁質(zhì)合成酶2基因和基因片段，由基因片段合成的dsRNA和dsRNA致死害蟲中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的一種昆蟲幾丁質(zhì)合成酶2基因，其核苷酸序列是SEQ?ID?NO：1，氨基酸序列是SEQ?ID?NO：2。是通過對東亞飛蝗EST數(shù)據(jù)庫的搜索，獲得1條幾丁質(zhì)合成酶2基因的片段，通過RACE-PCR擴(kuò)增獲得全長，命名為LmCHS2。其全長為5018bp，其中可讀框4569bp，編碼1523個氨基酸，5’-UTR和3’-UTR的長度分別為76bp和373bp。

本發(fā)明提供的一種昆蟲幾丁質(zhì)合成酶2基因片段，其核苷酸序列是SEQ?ID?NO：3，是根據(jù)SEQ?ID?NO：1設(shè)計上游引物SEQ?ID?NO：4和下游引物SEQ?ID?NO：5，通過PCR擴(kuò)增獲得。進(jìn)一步利用相關(guān)試劑盒合成dsRNA。

dsRNA在致死害蟲中的應(yīng)用：注射dsRNA到昆蟲體腔，結(jié)果表明：dsRNA可以特異性地沉默幾丁質(zhì)合成酶2基因的mRNA表達(dá)，昆蟲取食量明顯下降，不能滿足其生長發(fā)育所需要的營養(yǎng)及能量而死亡。

附圖說明

圖1：2齡東亞飛蝗若蟲注射dsRNA后對幾丁質(zhì)合成酶2基因(LmCHS2)轉(zhuǎn)錄的影響，β-actin為內(nèi)參基因(1為注射dsGFP的對照組，2為注射dsRNA的實(shí)驗(yàn)組)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：東亞飛蝗幾丁質(zhì)合成酶2基因全長的獲得

1)東亞飛蝗幾丁質(zhì)合成酶基因在東亞飛蝗表達(dá)序列標(biāo)簽EST數(shù)據(jù)庫的搜索

基于東亞飛蝗的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)數(shù)據(jù)庫，采用生物信息學(xué)方法對東亞飛蝗幾丁質(zhì)合成酶基因進(jìn)行搜索，經(jīng)過序列分析及比對后，共獲得1條幾丁質(zhì)合成酶2基因片段。

2)東亞飛蝗幾丁質(zhì)合成酶2基因RACE引物的設(shè)計

基于上述搜索得到的幾丁質(zhì)合成酶基因片段的堿基序列，采用primer?premier5.0軟件設(shè)計，引物序列如下：

5′RACE上游引物：5’-AGCCTGTACCTTTGGAGATTCCCTTG-3’

5′RACE下游引物：5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’

3′RACE上游引物：5’-CCTGGCTCTGGGAGGCTAAGAATGCG-3’

3′RACE下游引物：5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’

所有引物均由上海英濰捷基生物有限公司合成。

3)東亞飛蝗總RNA獲得