[發明專利]昆蟲幾丁質合成酶1基因片段及其dsRNA和應用

無效

• 申請號: 201010163607.3
• 申請日: 2010-04-30
• 公開（公告）號: CN101831444A
• 公開（公告）日: 2010-09-15
• 發明（設計）人: 張建珍;劉曉健;馬恩波;楊美玲;郭亞平
• 申請（專利權）人: 山西大學
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N15/113;A01N61/00;A01P7/04
• 代理公司: 山西五維專利事務所(有限公司) 14105
• 代理人: 楊耀田

技術領域

本發明涉及生物技術領域。具體涉及昆蟲幾丁質合成酶1基因片段及其dsRNA和dsRNA致死害蟲中的應用。

背景技術

農業害蟲為害是我國農業產量的重要制約因素，長期施用化學殺蟲劑導致一系列問題：1)昆蟲出現抗藥性，用藥劑量加大，防治成本提高；2)農藥殘留導致環境污染嚴重；3)對非靶標生物有較大影響。現有生物殺蟲劑在害蟲防治中應用較廣，但殺蟲時間較長且效果緩慢。

RNA干擾(RNAi)是一種由雙鏈RNA分子引起的特異性轉錄后基因沉默現象，2006年獲諾貝爾獎。RNAi的發現不僅為基因的功能研究提供了方法上的突破，同時也為人類疾病治療和作物害蟲防治開辟了新的途徑。2007年，“Nature?Biotechnology”雜志先后兩篇論文報道了施用表達靶向害蟲重要致死基因V-ATPase?A，CYP6AE14?and?GST1的dsRNA轉基因植物作為一種控制病蟲害的新方法(Baum?et?al，2007；Mao?et?al，2007)。2008年，Price和Gatehouse提出了基于RNAi的害蟲防治策略。基于RNA干擾技術的害蟲防治具有如下優勢：1)選擇對害蟲專一的基因進行干擾，對高等動物和人類是安全的；2)抗蟲具有專一性，對非靶標生物無殺傷作用；3)對環境無毒無害。

研究表明，RNA干擾技術能夠有效控制特殊的植物害蟲，在害蟲防治領域具有重要的發展前景。而實現基于RNAi進行害蟲有效控制的關鍵是篩選對昆蟲高效致死的dsRNA。

幾丁質合成和代謝是昆蟲等節肢動物特有的生物學現象，由于人類和其它高等動物沒有幾丁質，因此昆蟲幾丁質合成系統已被公認為新型殺蟲劑作用的靶標。幾丁質合成酶在昆蟲幾丁質合成的最后一步起著關鍵作用，采用RNA干擾技術，開展幾丁質合成酶dsRNA在害蟲防治中的應用具有重要意義。

發明內容

本發明的目的是提供一種昆蟲幾丁質合成酶1基因片段，由基因片段合成的dsRNA和dsRNA在致死害蟲中的應用。

本發明提供的一種昆蟲幾丁質合成酶1基因片段1，其核苷酸序列是SEQ?ID?NO：1。是通過設計昆蟲幾丁質合成酶的簡并引物后，PCR擴增獲得，命名為OcCHS1，其長度為312bp，編碼104個氨基酸。

本發明提供的一種昆蟲幾丁質合成酶1基因片段2，其核苷酸序列是SEQ?ID?NO：2，是根據SEQ?ID?NO：1設計上游引物SEQ?ID?NO：3和下游引物SEQ?ID?NO：4，通過PCR擴增獲得。進一步利用相關試劑盒合成dsRNA。

dsRNA在致死害蟲中的應用：注射dsRNA到昆蟲體腔，結果表明：dsRNA可以特異性地沉默幾丁質合成酶1基因的mRNA表達，昆蟲因蛻皮困難死亡。

附圖說明

圖1：3齡中華稻蝗若蟲注射dsRNA后對昆蟲生長發育的影響。注射dsRNA的實驗組出現蛻皮困難死亡的表型(1為注射dsGFP的對照組，2注射dsRNA的實驗組)。

具體實施方式

實施例1：中華稻蝗幾丁質合成酶1基因片段1的獲得

1)PCR引物的設計

根據已知昆蟲幾丁質合成酶的氨基酸保守序列，設計了如下簡并性引物：上游引物：CHS1F?5′-GAYGGNGAYATHGAYTT-3，下游引物：CHS1R?5′-TCYTCNCCYTGRTCRTA-3′；所有引物均由上海英濰捷基生物有限公司合成。

2)中華稻蝗總RNA的獲得

選取大小一致雌雄各半中華稻蝗5齡若蟲的體表，四頭一組，冷凍于液氮中，待提取RNA，提取RNA的具體操作步驟參照TaKaRa?Trizol試劑盒。

3)中華稻蝗第一鏈cDNA合成

第一鏈cDNA合成步驟參照SMART^TM?RACE?cDNA?Amplification試劑盒。

4)PCR擴增

以上述第一鏈cDNA為模板，根據Taq多聚酶(TIANGEN)說明書進行PCR擴增，將所擴增的片段進一步克隆、測序。

5)序列分析

利用Expasy網站中相關在線軟件和GENEDOC、基因探索者等軟件分析所得序列，在NCBI網站中使用BLAST功能進行序列同源性比對，確定所獲得的基因片段為中華稻蝗幾丁質合成酶1基因片段1。

實施例2：中華稻蝗幾丁質合成酶1基因片段2的獲得