[發(fā)明專利]一種提取動物組織總RNA的試劑和提取方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010163556.4
• 申請日: 2010-04-30
• 公開（公告）號: CN101831423A
• 公開（公告）日: 2010-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 高愛保;王蘭;袁慧
• 申請（專利權(quán)）人: 山西大學(xué)
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 山西五維專利事務(wù)所(有限公司) 14105
• 代理人: 楊耀田

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物技術(shù)，具體涉及一種提取動物組織總RNA的試劑和提取方法。

背景技術(shù)

RNA提取技術(shù)不僅是分子生物學(xué)技術(shù)的重要組成部分，也是功能基因組學(xué)研究技術(shù)的重要基礎(chǔ)。從RNA水平研究生物體內(nèi)基因的調(diào)控機(jī)制，已成為分子生物學(xué)研究的一個重要手段。許多分子生物技術(shù)包括RNA作圖，Northern印跡、核酸酶保護(hù)試驗(yàn)、PT-PCR(reversetranscription?polymerase?chain?reaction)、real?time?PCR、cDNA文庫構(gòu)建等實(shí)驗(yàn)的成效在很大程度上取決于RNA的質(zhì)量。由于RNA不穩(wěn)定，所以提取時比DNA面臨更多的困難。實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵是有無RNA酶的污染。在提取RNA時，最大程度的避免外源RNA酶的污染和抑制內(nèi)源RNA酶的活力，因此，創(chuàng)造一個無RNA酶的環(huán)境，嚴(yán)格防止RNA酶污染是成功提取RNA的關(guān)鍵。

生物組織、細(xì)胞RNA的提取是目前分子生物學(xué)研究的基本方法之一。由于自然界大量存在RNA酶，RNA的提取產(chǎn)物極易降解。因此，如何快速提取RNA并防止RNA降解一直是分子生物學(xué)研究要解決的難題。有的動物組織如螃蟹肝胰腺組織中含大量內(nèi)源酶，極易使RNA降解，用本試劑提取的RNA產(chǎn)量高、穩(wěn)定性好、純度高。市場上的RNA提取試劑盒(如TRIzol)極其昂貴，給普通分子實(shí)驗(yàn)帶來了巨大的成本。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種成本低、穩(wěn)定性好的提取動物組織總RNA的試劑和提取方法。

本發(fā)明提供的一種提取動物組織總RNA的試劑，組分按重量份數(shù)計：胍乙酸30-40份，十二烷基硫酸鈉0.1-0.3份，苯酚5-10份，滅菌蒸餾水100份；冰醋酸調(diào)節(jié)pH至5-6。-20℃-4℃保存，有效期為1-2年。

本發(fā)明提供的一種動物組織總RNA提取方法，包括如下步驟：

將上述試劑加入高溫滅菌離心管，按組織與試劑重量比1∶8-10，將組織加入離心管中，冰浴勻漿，直至無顆粒透明狀，室溫靜置5-20分鐘；10000-13000rmp離心2-5min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中；加入上清液1/3以上體積的氯仿，震蕩混勻；10000-13000rmp離心2-5min，將上清液轉(zhuǎn)移至第三離心管中；加入上清液1/2體積的10M?LiCL(或20％Li₂SO₄)和1/2體積的冰凍異丙醇，充分混勻，靜置10-20min；10000-13000rmp離心2-5min，回收沉淀，用75％的乙醇洗滌得總RNA，-80℃保存。

用本發(fā)明試劑提取動物組織總RNA操作過程簡單，時間短，成本低，總RNA產(chǎn)品純度高，穩(wěn)定性好。

附圖說明

圖1用本試劑提取長江華溪蟹組織總RNA瓊脂糖電泳圖

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：

將胍乙酸40g、十二烷基硫酸鈉0.1g、苯酚5g和滅菌蒸餾水100g混合均勻，用冰醋酸調(diào)節(jié)PH值至5.5。

實(shí)施例2：

將胍乙酸350g，十二烷基硫酸鈉2g、苯酚60g和滅菌蒸餾水1000g混合均勻，用冰醋酸調(diào)節(jié)PH值至5。

下面為使用本發(fā)明提取試劑提取總RNA的實(shí)施例：

實(shí)施例3：

將實(shí)施例1的試劑450μl加入經(jīng)高溫滅菌的離心管，將螃蟹鰓組織50mg加入離心管中，冰浴勻漿，直至無顆粒透明狀，室溫靜置10分鐘；10000rmp離心2min，吸出上清，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中；加入上清液1/3體積的氯仿，震蕩混勻；10000rmp離心3min，吸出上清，將上清液轉(zhuǎn)移至第三離心管中；加入上清液1/2體積的20％Li₂SO₄和1/2體積的冰凍異丙醇，充分混勻，-80℃靜置10min。10000rmp離心2min，回收沉淀，用75％的乙醇洗滌沉淀得總RNA。

上述總RNA沉淀溶于100μl無RNA酶的水中。

電泳檢測：電泳緩沖液為0.5×TBE緩沖液1L中加入3g乙酸胍，取5μl總RNA溶液，加6×RNA上樣緩沖液1.5μl，1％瓊脂糖甲醛凝膠80V電泳檢測，見圖1。

用分光光度計檢測總RNA溶液，測得的OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值在1.8～2.0，RNA的濃度＝(OD₂₆₀-OD₂₈₀)×40μg/ml×稀釋倍數(shù)，計算得出每克組織中提取出總RNA?1.2mg。

實(shí)施例4：