[發明專利]肝干細胞的選擇培養基、選擇性分離并擴增肝干細胞的方法及用于治療糖尿病的藥物組合物

有效

• 申請號: 201010162903.1
• 申請日: 2010-04-29
• 公開（公告）號: CN101851605A
• 公開（公告）日: 2010-10-06
• 發明（設計）人: 沈麗;黃啟明;郝麗敏;王亞軍;馬艷玲
• 申請（專利權）人: 北京弘潤天源生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074;A61K35/44;A61K35/28;A61K9/08;A61P3/10
• 代理公司: 北京銀龍知識產權代理有限公司 11243
• 代理人: 雒純丹

技術領域

本發明涉及一種干細胞的選擇培養基，使用該培養基選擇性分離并擴增干細胞的方法，以及包括前述方法獲得的干細胞的用于治療糖尿病的藥物組合物。更具體地，本發明涉及一種肝干細胞的選擇培養基，使用該培養基選擇性分離并擴增肝干細胞的方法，以及包括前述方法獲得的肝干細胞的用于治療糖尿病的藥物組合物。

背景技術

現有的分離和擴增肝干細胞的方法操作繁復、成本高，分離得到的肝干細胞純度低、擴增效率低、容易分化變性，并且在分離和擴增過程使用的培養基中含有很多對人體有害的藥物，使分離和擴增得到的肝干細胞在制備成藥物組合物時安全性差。

例如，CN?1611599A公開的由人臍帶血和大鼠骨髓分離干細胞使用了免疫磁珠標記技術，經高梯度磁場分選，才能完成干細胞的分離，其所分離干細胞是多種干細胞的混合物，并且其分離干細胞的目的是誘導該干細胞中的肝干細胞分化為肝細胞。

US?6129911公開了從肝組織中分離肝干細胞的方法，該方法不僅需要大量的肝組織，而且必須使用磁珠(Dynabead)剔除鼠膽管特異性細胞和間皮細胞，并且需要分選磁珠(magnetic?bead)來富集肝干細胞，并且富集所得的細胞群(cell?cluster)中還含有肝細胞。

綜上，亟需一種操作簡單、成本低、分離純度高、擴增效率高且傳代細胞性質穩定的安全的分離和擴增肝干細胞的方法。

發明內容

本發明的目的是克服現有的分離和擴增肝干細胞的方法操作繁復、成本高，分離得到的肝干細胞純度低、擴增效率低、容易分化變性，并且在分離和擴增過程使用的培養基中含有很多對人體有害的藥物，使分離和擴增得到的肝干細胞在制備成藥物組合物時安全性差的缺點，提供一種肝干細胞的選擇培養基，使用該培養基的分離和擴增肝干細胞的方法操作簡單、成本低、分離純度高、擴增效率高且傳代細胞性質穩定。

本發明提供了一種肝干細胞的選擇培養基，所述選擇培養基包括液體基礎培養基，其中，以所述液體基礎培養基的體積為基準，所述選擇培養基還含有1-20體積％的胎牛血清、5-100ng/mL的人表皮生長因子和5-100ng/mL的堿性成纖維細胞生長因子。

本發明還提供了一種從離體組織中選擇性分離并擴增肝干細胞的方法，其中，所述方法使用本發明所述的選擇培養基培養所述離體組織。

本發明還提供了一種用于治療糖尿病的藥物組合物，其中，所述藥物組合物包括本發明所述從離體組織中選擇性分離并擴增肝干細胞的方法獲得的肝干細胞，以及和藥學上可接受的載體或賦形劑。

使用本發明的選擇培養基的本發明的從離體組織中選擇性分離并擴增肝干細胞的方法，能夠高效分離和大量擴增肝干細胞，并且經10代傳代擴增的肝干細胞仍然保持與原代肝干細胞相同的性狀。由于本發明的選擇培養基選擇性強，原代培養得到的肝干細胞純度即可達到90％以上，傳代培養得到的肝干細胞純度可達到95％以上，隨傳代代數增加所得肝干細胞的純度可以達99％以上，甚至接近100％。因此，本發明的方法無需使用磁珠等高成本安全性差的藥物就能達到更高純度的分離效果，避免了繁復的操作，因而降低了成本，并且由該方法得到的肝干細胞的安全性大大提高，可以制備成本發明用于治療糖尿病的藥物組合物。本發明用于治療糖尿病的藥物組合物不僅安全性好，而且能在體內修復糖尿病中損傷的胰島β細胞，并消除胰島素抵抗，從而為克服糖尿病依賴胰島素治療，甚至根治糖尿病提供了可能。

附圖說明

圖1為實施例1分離并傳代的肝干細胞生長形態照片(光學顯微鏡放大倍數40倍)；

圖2為實施例4的中間品肝干細胞表達蛋白的熒光免疫照片(熒光顯微鏡放大倍數40倍)，其中，圖2A為4，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸(DAPI)染色熒光免疫照片，圖2B為鼠抗人血清甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)標記后二抗顯色熒光免疫照片，圖2C為圖2A和圖2B疊加得到的熒光免疫照片；

圖3為實施例4的中間品肝干細胞表達蛋白的熒光免疫照片(熒光顯微鏡放大倍數40倍)，其中，圖3D為4，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸(DAPI)染色熒光免疫照片，圖3E為鼠抗人細胞角蛋白19(Cytokeratin-19，CK19)標記后二抗顯色熒光免疫照片，圖3F為圖3D和圖3E疊加得到的熒光免疫照片；

圖4為鼠抗人巢蛋白(Nestin)二抗顯色的實施例4的中間品肝干細胞表達蛋白的熒光免疫照片(熒光顯微鏡放大倍數40倍)；