[發(fā)明專利]一種棘胸蛙微衛(wèi)星DNA標(biāo)記Ⅱ及其用途

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010162348.2
• 申請(qǐng)日: 2008-10-23
• 公開（公告）號(hào): CN101805734A
• 公開（公告）日: 2010-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭榮泉;葉容暉;楊光;成斌
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 杭州中成專利事務(wù)所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

本發(fā)明是申請(qǐng)日為2008.10.23、申請(qǐng)?zhí)枮?00810121952.3的《一種棘胸蛙微衛(wèi)星DNA 標(biāo)記及其用途》的分案申請(qǐng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子標(biāo)記技術(shù)，具體涉及一種棘胸蛙的DNA分子遺傳標(biāo)記及其用途。

背景技術(shù)

微衛(wèi)星(又稱為簡(jiǎn)單重復(fù)序列，SSR)是由1-6個(gè)核苷酸組成的短序列串聯(lián)重復(fù)多次 而組成的一段DNA。由于微衛(wèi)星側(cè)翼序列相對(duì)保守，根據(jù)其側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物，可用PCR 擴(kuò)增出微衛(wèi)星位點(diǎn)的序列。由于微衛(wèi)星中重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)不同，因而擴(kuò)增出的微衛(wèi)星 序列的長(zhǎng)度呈現(xiàn)多態(tài)性。微衛(wèi)星序列廣泛存在于真核生物基因組中，而且隨機(jī)分布，具有 高度多態(tài)性，選擇上中性，共顯性等特點(diǎn)，是十分有效的遺傳標(biāo)記，被廣泛應(yīng)用于遺傳圖 譜構(gòu)建、基因定位、遺傳關(guān)系分析、品種鑒定等領(lǐng)域。如用微衛(wèi)星標(biāo)記分析苧麻品種的親 緣關(guān)系(Zhou等，2005，Progress?in?Natural?Science，15：137-142)、用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記 進(jìn)行豬品種分類的專利申請(qǐng)“適于豬品種分類的豬微衛(wèi)星DNA標(biāo)記”(公開號(hào)CN 1370834A)、用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記進(jìn)行家蠶分子連鎖遺傳分析的專利申請(qǐng)“家蠶的SSR標(biāo) 記及其應(yīng)用”(公開號(hào)CN?1970792A)。

棘胸蛙(Paa?spinosa?David)，屬兩棲綱、無(wú)尾目、蛙科。棘胸蛙個(gè)體大，肉質(zhì)細(xì)嫩潔 白，味道鮮美，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，素有“百蛙之王”的美稱。由于人為捕 殺和自然環(huán)境的惡化，野生棘胸蛙資源遭到嚴(yán)重破壞，開展棘胸蛙人工養(yǎng)殖既有助于保護(hù) 野生資源，又能滿足市場(chǎng)需求。現(xiàn)在，棘胸蛙是我國(guó)重要的養(yǎng)殖蛙類之一，但是由于其基 礎(chǔ)研究薄弱，要實(shí)現(xiàn)規(guī)模養(yǎng)殖還有許多亟待解決的問(wèn)題，其中包括需要一套有效的分子標(biāo) 記對(duì)其進(jìn)行遺傳關(guān)系分析、種質(zhì)資源調(diào)查、標(biāo)記輔助育種等。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種棘胸蛙微衛(wèi)星DNA標(biāo)記II，利用這些分子標(biāo)記 能對(duì)棘胸蛙進(jìn)行遺傳分析、種質(zhì)資源調(diào)查和輔助育種。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種棘胸蛙微衛(wèi)星DNA標(biāo)記II，該微衛(wèi)星DNA標(biāo) 記II的核苷酸序列為SEQ?ID?NO：4，該微衛(wèi)星編號(hào)為Psp19。

作為本發(fā)明的棘胸蛙微衛(wèi)星DNA標(biāo)記II的改進(jìn)：棘胸蛙微衛(wèi)星DNA標(biāo)記II引物為下列 引物對(duì)，其中的核苷酸序列為5′→3′，

Psp?19????正向：TCACAATCGACGTAATGG

??????????反向：ACACACAGAGGGTCACACT。

本發(fā)明還同時(shí)提供了棘胸蛙微衛(wèi)星DNA標(biāo)記II的用途，其特征是：用于對(duì)棘胸蛙進(jìn)行 遺傳分析、種質(zhì)資源調(diào)查或輔助育種。

實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明的技術(shù)方案包括棘胸蛙(CA)n微衛(wèi)星富集文庫(kù)的構(gòu)建、含微衛(wèi)星序列 的陽(yáng)性克隆的篩選及測(cè)序，確定了8個(gè)多態(tài)性豐富的微衛(wèi)星標(biāo)記Psp16、Psp17、Psp18、 Psp19、Psp20、Psp21、Psp22、Psp23。

本發(fā)明旨在分離克隆微衛(wèi)星DNA標(biāo)記，建立棘胸蛙的微衛(wèi)星DNA的技術(shù)體系并利用這 些分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳分析、種質(zhì)資源調(diào)查和輔助育種。因此，本發(fā)明提供了8個(gè)棘胸蛙微 衛(wèi)星位點(diǎn)的DNA序列及擴(kuò)增上述8個(gè)棘胸蛙微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物序列和擴(kuò)增方法，8個(gè)棘 胸蛙微衛(wèi)星位點(diǎn)用于棘胸蛙種質(zhì)資源研究，遺傳關(guān)系分析，標(biāo)記輔助選種和標(biāo)記輔助育種， 重復(fù)性好，多態(tài)性高，是一種可靠有效的分子標(biāo)記。

附圖說(shuō)明

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

圖1是本發(fā)明涉及的13個(gè)棘胸蛙自然種群的structure聚類圖(K＝3)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1、棘胸蛙(CA)_n微衛(wèi)星富集文庫(kù)的構(gòu)建

依次進(jìn)行以下步驟：

1)、用經(jīng)典的酚-氯仿抽提法提取棘胸蛙(廣西龍勝)基因組DNA。用限制性內(nèi)切酶 Sau3AI酶切棘胸蛙基因組DNA，酶切產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳，紫外光下切下 300-1000bp大小的DNA片段并用凝膠回收試劑盒純化回收酶切產(chǎn)物。