[發明專利]一種制備羥基脂肪酸酯均聚物的方法及其專用菌

有效

• 申請號: 201010161314.1
• 申請日: 2010-04-28
• 公開（公告）號: CN101845414A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發明（設計）人: 陳國強
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P7/62;C12R1/40
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

1.重組惡臭假單胞菌，如下述1)、2)、3)、4)或5)所示：

1)所述重組惡臭假單胞菌是按照包括如下步驟的方法制備的：使出發惡臭假單胞菌中的3-羥基脂酰輔酶A脫氫酶編碼基因和3-酮酰輔酶A硫解酶編碼基因的編碼功能喪失，得到重組惡臭假單胞菌，記作重組惡臭假單胞菌I；

2)所述重組惡臭假單胞菌是按照包括如下步驟的方法制備的：使所述重組惡臭假單胞菌I中的3-羥基脂酰載脂蛋白輔酶A轉移酶編碼基因的編碼功能喪失，得到重組惡臭假單胞菌，記作重組惡臭假單胞菌II；

3)所述重組惡臭假單胞菌是按照包括如下步驟的方法制備的：向所述重組惡臭假單胞菌II中導入聚-β-羥基丁酸合成酶編碼基因和4-羥基丁酰輔酶A轉移酶編碼基因，得到重組惡臭假單胞菌，記作重組惡臭假單胞菌III；

4)所述重組惡臭假單胞菌是按照包括如下步驟的方法制備的：向所述重組惡臭假單胞菌II中導入PHA顆粒結合蛋白的編碼基因、烯脂酰輔酶A水合酶的編碼基因和PHA合成酶編碼基因，得到重組惡臭假單胞菌，記作重組惡臭假單胞菌IV；

5)所述重組惡臭假單胞菌是按照包括如下步驟的方法制備的：使所述重組惡臭假單胞菌II中的3-羥基脂酰輔酶A脫氫酶的編碼基因和脂酰輔酶A脫氫酶的編碼基因的編碼功能喪失，得到重組惡臭假單胞菌，記作重組惡臭假單胞菌V。

2.根據權利要求1所述的重組惡臭假單胞菌，其特征在于：

所述1)所示重組惡臭假單胞菌中，所述使出發惡臭假單胞菌中的3-羥基脂酰輔酶A脫氫酶編碼基因和3-酮酰輔酶A硫解酶編碼基因的編碼功能喪失是通過同源重組實現的；所述同源重組的方法包括如下步驟：向所述出發惡臭假單胞菌中導入序列表中序列1所示DNA和序列表中序列2所示DNA，所述序列表中序列1所示DNA與所述出發惡臭假單胞菌中的3-羥基脂酰輔酶A脫氫酶的編碼基因發生同源重組，所述序列表中序列2所示DNA與所述出發惡臭假單胞菌中的3-酮酰輔酶A硫解酶的編碼基因發生同源重組，得到所述重組惡臭假單胞菌I；

所述2)所示重組惡臭假單胞菌中，所述使所述重組惡臭假單胞菌I中的3-羥基脂酰載脂蛋白輔酶A轉移酶編碼基因的編碼功能喪失是通過同源重組實現的；所述同源重組的方法包括如下步驟：向所述重組惡臭假單胞菌I中導入序列表中序列3所示DNA，所述序列表中序列3所示DNA與所述重組惡臭假單胞菌I中的3-羥基脂酰載脂蛋白輔酶A轉移酶的編碼基因發生同源重組，得到所述重組惡臭假單胞菌II；

所述3)所示重組惡臭假單胞菌中，所述聚-β-羥基丁酸合成酶編碼基因和4-羥基丁酰輔酶A轉移酶編碼基因是通過重組載體導入的；

所述重組載體是按照如下方法制備得到的：將質粒pKSSE5.3用限制性內切酶BamHI和EcoRI進行酶切，回收大片段，記作大片段I；將載體pBBR1-MCS2用限制性內切酶BamHI和EcoRI進行酶切，回收載體大片段，記作大片段II；將所述大片段I和所述大片段II連接，得到所述重組載體；

所述4)所示重組惡臭假單胞菌中，所述PHA顆粒結合蛋白的編碼基因、烯脂酰輔酶A水合酶的編碼基因和PHA合成酶編碼基因是通過重組載體導入的；所述重組載體是將所述PHA顆粒結合蛋白的編碼基因、PHA合成酶編碼基因和烯脂酰輔酶A水合酶的編碼基因構成的融合基因插入載體pBBR1-MCS2的KpnI和EcoRI位點得到的；所述PHA顆粒結合蛋白的編碼基因位于所述融合基因的上游，所述PHA合成酶編碼基因位于所述融合基因的中游，所述烯脂酰輔酶A水合酶的編碼基因位于所述融合基因的下游；

所述5)所示重組惡臭假單胞菌中，所述使所述重組惡臭假單胞菌II中的3-羥基脂酰輔酶A脫氫酶的編碼基因和脂酰輔酶A脫氫酶的編碼基因的編碼功能喪失是通過同源重組實現的；所述同源重組的方法包括如下步驟：向所述重組惡臭假單胞菌II中導入序列表中序列9所示DNA和序列表中序列10所示DNA，所述序列表中序列9所示DNA與所述重組惡臭假單胞菌II中的3-羥基脂酰輔酶A脫氫酶的編碼基因發生同源重組，所述序列表中序列10所示DNA與所述重組惡臭假單胞菌II中的脂酰輔酶A脫氫酶的編碼基因發生同源重組，得到所述重組惡臭假單胞菌V。