[發(fā)明專利]利用fAFLP標記技術分析貝類遺傳多樣性的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010161282.5
• 申請日: 2010-04-07
• 公開（公告）號: CN102041303A
• 公開（公告）日: 2011-05-04
• 發(fā)明（設計）人: 董迎輝;林志華
• 申請（專利權）人: 浙江萬里學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 寧波誠源專利事務所有限公司 33102
• 代理人: 袁忠衛(wèi);景豐強

技術領域

本發(fā)明涉及一種分析貝類遺傳多樣性的方法，更具體地說是一種利用fAFLP標記技術分析貝類遺傳多樣性的方法。

背景技術

AFLP(Amplified?Fragment?Length?Polymorphism，擴增片段長度多態(tài)性)技術是目前使用廣泛且有效的遺傳多樣性檢測方法，它集RFLP(Restriction?Fragment?LengthPolymorphism，限制性片段長度多態(tài)性)技術的穩(wěn)定性和RAPD(Random?AmplifiedPolymorphism?DNA，隨機擴增多態(tài)性DNA)技術的高效性于一身，具有所需DNA量小、標記信息量大、多態(tài)性豐富、靈敏度高、快速高效、所得數(shù)據(jù)可靠等諸多優(yōu)點，且不需預先知道研究生物的遺傳背景，不受組織器官種類、發(fā)育階段、生境條件等因素的影響，結(jié)果遵從孟德爾分離的特點，已被廣泛應用于多種生物的遺傳多樣性分析、種質(zhì)鑒定、遺傳圖譜構建、目的基因的克隆和定位等多個遺傳學研究領域。在貝類研究方面，潘潔等(2002)應用AFLP技術對櫛孔扇貝的中國長島群體和韓國東部、韓國西部群體3個群體進行了遺傳多樣性分析。陳省平等(2005)對我國4種主要養(yǎng)殖扇貝——櫛孔扇貝、華貴櫛孔扇貝、蝦夷扇貝、海灣扇貝的群體遺傳多樣性及特異性AFLP標記進行了研究；萬俊芬等(2004)研究了鮑養(yǎng)殖群體AFLP標記位點及其遺傳結(jié)構的影響。另外，潘潔等(2002)對櫛孔扇貝抗病品系的AFLP標記進行了分析，發(fā)現(xiàn)選育群體的遺傳組成已經(jīng)發(fā)生了一些改變。

近年發(fā)展起來的fAFLP(熒光AFLP)技術是在傳統(tǒng)AFLP技術的基礎上，利用熒光物質(zhì)(FAM、ROX、JOE等)標記過的選擇性引物擴增，產(chǎn)物在自動DNA測序儀上進行檢測，所得圖像和數(shù)據(jù)可以自動采集，并且由于熒光內(nèi)參的使用使實驗結(jié)果更具準確性和可比性。相對于傳統(tǒng)AFLP技術來說，fAFLP技術省去了做膠、銀染的麻煩和不穩(wěn)定。

所以，fAFLP技術不僅秉承了傳統(tǒng)技術的優(yōu)點，而且在高效性、穩(wěn)定性、準確性和可重復性等方面表現(xiàn)得更加優(yōu)越，將成為分子標記技術發(fā)展的主流和趨勢。目前在海洋貝類方面，彭永興等(2008)利用fAFLP技術對文蛤(Meretrix?meretrix)、青蛤(Cyclinasinensis)、菲律賓蛤仔(Ruditapes?philippinarum)和硬殼蛤(Mercenaria?mercenaria)4種簾蛤科貝類的群體遺傳多樣性和種間關系進行了研究，該文獻中對酶切、預擴增、選擇性擴增方面作了試驗，并給我們提供了一組反應體系；林志華等(2009)利用fAFLP標記技術，對采集于廣西的形態(tài)和殼色變異很大的2個文蛤群體以及山東文蛤群體進行了遺傳結(jié)構和親緣關系研究，該文獻在酶切、預擴增、選擇性擴增方面沒有提供可參考的反應體系。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術問題是針對上述的技術現(xiàn)狀而另外提供一種高效、穩(wěn)定、準確的利用fAFLP標記技術分析貝類遺傳多樣性的方法。

本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案為：利用fAFLP標記技術分析貝類遺傳多樣性的方法，依次經(jīng)過貝類DNA提取，限制性內(nèi)切酶消化DNA，對酶切后的DNA進行接頭連接，PCR預擴增和選擇性擴增，產(chǎn)物檢測及圖像和數(shù)據(jù)的采集和分析，其特征在于所述的PCR預擴增和選擇性擴增包括如下步驟：

a、DNA片段的預擴增：取5μL連接完成的DNA樣品，加入：50ng/μL的Mse?I引物1.5μL，50ng/μL的EcoR?I引物1.5μL，10×PCR?Buffer?5.0μL，5U/μL的Taq酶0.2μL，2.5mM?d?NTP?4.0μL，加水至50μL，混勻后，在如下PCR條件擴增：94℃預變性2min，94℃變性30S，56℃退火30S，72℃延伸60S，20個循環(huán)，引物帶有一個堿基，為M00+C，預擴增完成后，在1％瓊脂糖膠中檢測預擴增的效果；

預擴增引物為：E01：5′-GACTGCGTACCAATTCA-3′；M02：5′-GATGAGTCCTGAGTAAC-3′；