[發(fā)明專利]慢性粒細(xì)胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA及其制備方法和應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010160423.1
• 申請日: 2010-04-23
• 公開（公告）號: CN101837134A
• 公開（公告）日: 2010-09-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林晨;田紅霞;高永鵬;陳少華;楊力建;周羽竝;李揚(yáng)秋
• 申請（專利權(quán)）人: 暨南大學(xué)
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61K39/00;A61P35/02;C12N15/12;C12N15/85
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉;陳燕嫻

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于血液腫瘤免疫治療技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種慢性粒細(xì)胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

目前，對于慢性粒細(xì)胞白血病(Chronic?myelogenous?leukemia，CML)的治療主要有傳統(tǒng)化療、IFN-α和酪氨酸激酶抑制劑靶向治療等。雖然這些治療方法已經(jīng)能夠在很大程度上提高患者的生存質(zhì)量，患者的預(yù)后也有了較大改善，但腫瘤的微小殘留病變(minimal?residual?disease，MRD)卻很難被現(xiàn)行治療方案根除。造血干細(xì)胞移植雖然能夠根除MRD，但骨髓來源少，配型成功率低，高昂的移植費(fèi)用以及嚴(yán)重的移植相關(guān)并發(fā)癥限制了該療法的推廣。由于許多白血病患者體內(nèi)都存在由于染色體易位所形成的融合基因，利用融合基因作為誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗白血病治療的靶點(diǎn)已經(jīng)成為眾多研究人員追求的目標(biāo)。由于體外表達(dá)的蛋白不一定具有與體內(nèi)蛋白一致的天然構(gòu)象，而且外源蛋白進(jìn)入體內(nèi)后以誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)為主，而DNA疫苗則能夠有效地克服這些缺陷，同時誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫。在常規(guī)治療結(jié)束后輔以CML特異的DNA疫苗治療是有希望根除MRD的方法之一。

BCR/ABL融合基因是CML發(fā)病以及應(yīng)用酪氨酸激酶抑制劑甲磺酸伊馬替尼治療有效的分子基礎(chǔ)，是一個特異的白血病抗原。表達(dá)BCR/ABL融合基因的細(xì)胞可誘導(dǎo)T細(xì)胞克隆性增殖，提示該細(xì)胞內(nèi)的融合蛋白可以被MHC分子加工和提呈到細(xì)胞表面，因此可以利用BCR/ABL融合蛋白或融合基因誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，或者誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對BCR/ABL的特異性CTL，達(dá)到免疫治療的目的。Ji等研究發(fā)現(xiàn)利用跨越BCR/ABL融合基因的融合點(diǎn)的基因片段構(gòu)建的DNA疫苗能夠在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性免疫保護(hù)作用。利用BCR/ABL融合基因制備DNA疫苗是有希望根除CML的MRD的方法之一。

但單獨(dú)的多肽疫苗所產(chǎn)生的免疫效應(yīng)較弱，尋找合適的免疫佐劑成為臨床實(shí)際應(yīng)用必須要解決的重點(diǎn)所在。超抗原可與抗原提呈細(xì)胞表面的MHC-II類分子及TCRVβ區(qū)CDR3外側(cè)區(qū)域結(jié)合，而不涉及TCRVβ區(qū)CDR3及TCRα的識別，這種激活T細(xì)胞的獨(dú)特方式可產(chǎn)生極強(qiáng)的免疫應(yīng)答。目前較有研究基礎(chǔ)的超抗原主要是金黃色葡萄球菌腸毒素A(Staphylococcal?Enterotoxin?A，SEA)等，SEA強(qiáng)大的T細(xì)胞激活功能使其成為CML免疫治療的佐劑。

目前對于制備BCR/ABL基因疫苗特異性目的基因的選擇尚無定論，如何篩選出具有最佳免疫原性的BCR/ABL基因片段仍是此類研究所面臨的核心問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種慢性粒細(xì)胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA。該DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA是能夠在真核細(xì)胞內(nèi)同時表達(dá)BCR/ABL和SEA蛋白的質(zhì)粒。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述慢性粒細(xì)胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA的制備方法。

本發(fā)明的再一目的在于提供上述慢性粒細(xì)胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA的應(yīng)用。所述用于慢性粒細(xì)胞白血病特異免疫治療的DNA疫苗是一種能夠在真核細(xì)胞中同時表達(dá)BCR/ABL蛋白和SEA蛋白的DNA疫苗，它能夠誘導(dǎo)CML患者機(jī)體產(chǎn)生針對CML細(xì)胞的特異性CTL，從而清除患者體內(nèi)的微小殘留病變，達(dá)到治愈CML的目的。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：一種慢性粒細(xì)胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA，含有pIRES質(zhì)粒、BCR/ABL基因和SEA基因，BCR/ABL基因和SEA基因分別位于pIRES質(zhì)粒上的IRES元件兩側(cè)的多克隆位點(diǎn)上；其中，pIRES質(zhì)粒為商業(yè)性的質(zhì)粒，含有多克隆位點(diǎn)A(MCS?A)、多克隆位點(diǎn)B(MCS?B)和IRES元件，MCS?A和MCS?B分別位于IRES元件的兩側(cè)，BCR/ABL基因可以位于MCS?A或MCS?B上，SEA基因可以位于MCS?A或MCS?B上；

所述BCR/ABL基因(大小為336bp)的核苷酸序列如下：

CCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCA

AGGAAAACCTTCTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTG